IL21对非霍奇金淋巴瘤细胞凋亡及survivin基因表达的影响

　　作者：李丽霞,张英,杨志诚,王玉洲,罗伟仁　　作者单位：1.广东医学院附属医院肿瘤中心,广东 湛江 524001;2.广东医学院病理学教研室, 广东 湛江 524023

　　【摘要】目的：探讨IL21对非霍奇金淋巴瘤细胞的生长和凋亡的影响及其可能机制。方法:通过MTT (噻唑兰比色法)检测观察IL21对Raji细胞生长的影响;流式细胞仪观察24 h后IL21对细胞凋亡的影响;RTPCR (逆转录聚合酶链式反应)检测IL21对survivin mRNA的表达水平的影响。结果:IL21对Raji细胞生长有抑制作用，呈剂量依赖关系(P<0.05);0，10，50，250 μg/L组细胞凋亡率分别为0.00%，7.26%，15.12%，22.57%，药物组与对照组比较，差异有统计学意义(P<0.01或<0.05);随着IL21浓度升高，survivin的表达水平逐步下降(P<0.05)。结论:IL21可以抑制淋巴瘤细胞的生长和诱导其凋亡，其机制可能与降低survivin的表达有关。

　　【关键词】 淋巴瘤,非霍奇金,细胞死亡 IL 21 survivin

　　[ABSTRACT] Objective: To study the effects of interleukin21 (IL21) on the growth and apoptosis of the nonHodgkin lymphoma's cell and mechanism. Methods： MTT was used to investigate proliferation of Raji cells; flow cytometry (FCM) was used to investigate the effects of IL21 on apoptosis of Raji cells in 24 h; the expression of survivin mRNA in Raji cells treated with different concentration of IL21 were examined by RTPCR. Results： The growth of Raji cells was inhibited by IL21, which presented doseeffect relation (P<0.05). The apoptosis rates of cells corresponding to concentration of 0，10，50，250 μg/L were 0.00%，7.26%，15.12%，22.57% respectively. Compared the indicators between trial group and control group, there were significant differences (P<0.01 or <0.05). The expression rates of survivin mRNA decreased following the gradually increased concentrations of IL21(P<0.05). Conclusion： IL21 can inhibit lymphoma's cell growth and induce cell apoptosis, which may relate to decreasing expression of survivin.

　　[KEY WORDS] Lymphoma, nonHodgkin; Apoptosis; IL21;Survivin.

　　非霍奇金淋巴瘤是小儿淋巴瘤中较常见的一型,恶性度高,病变发展迅速,多数患者预后较差[1]。近年来研究表明，凋亡抑制蛋白(IAP)家族新成员survivin通过其抗凋亡作用, 在淋巴瘤的发生、发展中起重要作用[2]。IL21是由活化CD4+T细胞合成的1型细胞因子，通过特异性结合IL21受体可促进不同阶段的B、T淋巴细胞和NK细胞增殖。目前，IL21在体内抗肿瘤的研究已有报道[3，4]，但其对恶性淋巴瘤作用的报道却很少。本实验拟通过观察IL21对非霍奇金淋巴瘤Raji细胞凋亡的诱导作用及对survivin基因表达的影响，初步探讨其可能的作用机制。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料

　　人非霍奇金淋巴瘤细胞株Raji 购自中国科学院细胞研究所。IL21购自美国BIOSOURCE公司，用无菌RPMI1640液溶解配制成100 mg/L的储存液;MTT、碘化丙锭(PI)购自美国SIGMA公司;新生小牛血清购自杭州四季青生物公司; RTPCR试剂盒购自德国QIAGEN公司; survivin及GAPDH引物由上海生物工程技术有限公司合成。

　　1.2 细胞培养

　　Raji细胞于RPMI1640培养液中(含10%新生小牛血清、青霉素100 U/mL，链霉素100 U/mL、0.056%NaHCO3 ，调节pH值至7.4)，置于37 ℃、5%CO2培养箱内常规培养。所有实验均用对数生长期的细胞。

　　1.3 MTT法检测Raji细胞生长影响

　　将对数生长期的Raji细胞制备成4×104/ mL单细胞悬液，按每孔90 μL 接种于96孔培养板，分别加上含IL21培养液，使其终浓度为0，10，50，250 μg/L。另设阴性对照组(只加细胞和培养液，不加药物)、空白调零组(仅加培养液)，各设6个复孔。在孵箱中分别24，48，72 h 后，加入MTT 100 μL，培养4 h，离心弃去液体，每孔加入100 μL DMSO充分溶解15 min。A570 nm测定各孔光密度值(OD值)，按以下公式计算：细胞生长抑制率(%)=(1-实验组OD值/对照组OD值)×100%。

　　1.4 流式细胞仪检测细胞凋亡情况

　　将Raji细胞制成1×106/个细胞悬液，设对照组(仅含等量的细胞和RPMI1640液)和实验组(10，50，250 μg/L的IL21培养液)，每组3个复孔。分别于CO2孵箱中培养24 h后收集细胞;PBS清洗、离心，用 0.5 mL PBS将余下细胞制成均匀的细胞悬液;滴入预冷的95%乙醇1.5 mL，吹打、固定12 h; 分析前，将乙醇中的细胞悬液离心(1 000 r/min，5 min)，加PI染色液1 mL置于室温30 min;流式细胞仪进行分析。

　　1.5 RTPCR检测各组survivin mRNA的表达

　　分别以10，50 μg/L IL21作用Raji细胞24 h，以未加药细胞为对照组。按Trizol 试剂盒说明书提取细胞总RNA，以1 μg RNA 为模板，按照逆转录试剂盒说明书合成cDNA，并进行聚合酶链反应(PCR)。PCR 条件为94 ℃ 45 s，56 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，循环30次，末次延长10 min 。PCR产物5 μL，加6×上样缓冲液1 μL混匀，上样于2%琼脂糖凝胶，90V恒压电泳90 min，溴乙啶紫外透射仪下拍照。采用图像分析软件BandScan5.0比较电泳条带的相对光密度值，获得survivin mRNA相对表达量。survivin长度为401 bp，上游引物5'TTCTTGGAGGGCTGCGCCT' 3，下游引物5'CCTGGTAGTGGTGCAGCCA'3。

　　1.6 统计学处理

　　本实验数据资料以(±s)表示,应用sas8.1软件包进行方差分析; P<0.05认为组间有显著性差异,P<0.01认为组间有高度显著性差异。

　　2 结果

　　2.1 IL21对Raji细胞生长的影响

　　MTT法结果显示，10，50，250 μg/L的IL21作用淋巴瘤细胞 24，48，72 h ，同一时间段，随IL21浓度的逐渐增加，其抑制作用随着浓度的递增而增加;同一浓度，随IL21作用时间的延长，其抑制作用也渐增强，P<0.05，呈时间—剂量依赖关系。

　　2.2 IL21对Raji细胞凋亡的影响

　　流式细胞仪检测结果显示，分别用浓度为0，10，50，250 μg /L的IL21作用于Raji细胞24 h后，随着IL21浓度增加，亚二倍峰(凋亡峰)所占比例逐渐增大，24 h观察结果10，50，250 μg/L组与对照组相比较，差异具有显著性(P﹤0.01或<0.05)。

　　2.3 IL21对survivin mRNA表达的影响

　　RTPCR结果显示， 随着药物浓度的增加，survivin条带变得越来越模糊，其表达逐渐下降，0，10，50 μg/L组survivin mRNA表达量分别为(2.528 9±0.759 7)、(1.854 6±0.523 6)、(1.132 0±0.324 5)。与对照组比较，药物组差异具有高度显著性(P﹤0.01)。

　　3 讨论

　　IL21是最近命名的1型细胞因子，由活化的CD4+T细胞合成，包括133个氨基酸残基和4个螺旋结构，与IL2、IL15同为细胞因子受体γc家族的单链蛋白质[5]。IL21选择性地在淋巴组织特别是NK细胞，B、T 淋巴细胞中表达，通过激活免疫细胞毒性作用来抑制肿瘤的生长和增殖。Wang G等[6]利用重组DNA质粒转化技术，使动物模型的血液内IL21处于高剂量浓度水平，结果发现，IL21可激活NK细胞产生细胞溶解作用，抑制了黑色素瘤细胞的生长。我们应用不同浓度的IL21作用于Raji细胞，通过MTT比色法检测观察IL21对Raji细胞生长抑制的影响，发现IL21能明显抑制Raji细胞的增殖。在IL21浓度为10 μg /L时，已出现抑制细胞增殖作用，随着IL21浓度的递增，增殖抑制率也逐渐增强(P<0.05)。

　　survivin是目前发现的IAP家族中抗凋亡作用最强的成员之一。survivin直接作用于caspase3和caspase7,抑制细胞凋亡。survivin在胚胎组织、转化细胞及多种肿瘤组织中表达,而在正常成人组织不表达或低表达,在基因诊断和靶向治疗中具有较大的研究价值[7]。研究表明， survivin高表达与某些肿瘤分化程度、预后不良相关[812]。本研究RTPCR结果表明，随着IL21浓度的增加，survivin mRNA的表达逐渐减少，0，10，50 μg/L组survivin mRNA表达量分别为(2.528 9±0.759 7)、(1.854 6±0.523 6)、(1.132 0±0.324 5)，各组间差异有高度显著性(P﹤0.01)。

　　综上所述，IL21可抑制淋巴瘤细胞的生长和增殖，诱导其凋亡;可能与降低survivin的表达有关，但其具体机制尚需我们进一步研究。

　　【参考文献】

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　　12 刘新,李颖,徐功立，等.Survivin在非霍奇金淋巴瘤中的表达及意义[J].山东大学学报(医学版),2007，45(3)：283284.