CD+4CD+25调节性T细胞表达在ITP和AIHA中的意义

　　作者：王欣,杨敬慈,张广杰,张建　　作者单位：河北省衡水市第二医院血液肿瘤科;河北医科大学第二医院血液科

　　【关键词】 CD+4CD+25调节性T细胞;特发性血小板减少性紫癜;自身免疫性溶血性贫血

　　CD+4CD+25T调节细胞(CD+4CD+25regulatory T cell，Treg)是一种表达白介素-2(IL-2)受体α链(CD25)的CD+4T细胞。CD+4CD+25T调节细胞具有低反应性和免疫抑制两大特点。低反应性是指体外很难繁殖和扩增;免疫抑制是指其具有抑制CD+4和CD+8细胞活化与增殖的能力。近年来，CD+4CD+25T调节细胞已成为自身免疫、肿瘤免疫、移植免疫等领域的研究热点。有报道CD+4CD+25T调节细胞比例降低易引起自身免疫疾病，而比例升高会导致肿瘤免疫失调[1]。本研究目的在于探讨CD+4CD+25Treg与特发性血小板减少性紫癜(ITP)、自身免疫性溶血性贫血(AIHA)发病的关系，以及治疗过程中CD+4CD+25Treg的变化，为更有效地治疗上述疾病提供理论依据。

　　1　资料与方法

　　1.1　一般资料

　　河北医科大学第二医院血液科和衡水市第二医院血液肿瘤科2008年1月至2009年1月门诊及住院收治的初治患者50例为研究组，分别为ITP 30例，AIHA 20例，所有病例均符合血液病诊断及疗效标准[2]。30例ITP患者，男8例，女22例;年龄14～59岁，中位年龄34岁。确诊后给予糖皮质激素治疗，泼尼松1 mg/kg(或等效剂量的甲基强的松龙)，给予4周，待血小板升至正常或接近正常后逐渐减量，以小剂量(每天5～10 mg)维持并随访。治疗期间辅以止血药物、补钙等，严重患者给予丙种球蛋白(0.4 g?kg-1?d-1，用5 d)静脉注射。20例AIHA患者，男4例，女16例;年龄15～63岁，中位年龄32岁。患者确诊后给予糖皮质激素治疗，强的松1 mg/kg (或等效剂量的甲基强的松龙)，给予4周，待血红蛋白正常或接近正常后逐渐减量，小剂量(每天5～10 mg)维持并随访。治疗期间辅补钙等。正常对照组20例，男5例，女15例;中位年龄32岁。检测患者及正常对照组外周血CD+4CD+25T辅助细胞、CD+3细胞、CD+4细胞的表达，部分患者进行动态观察，观察治疗1个月、3个月、6个月后的疗效及CD+4CD+25T辅助细胞的变化。

　　1.2　试剂与仪器

　　FITC标记的鼠抗人CD4单克隆抗体(CD4-FITC)、PC5标记的CD3单克隆抗体(CD3-PC5)、PE标记的CD25单克隆抗体(CD25-PE)、PE标记的IgG1(IgG1-PE)、溶血素均为美国Beckman coulter 公司产品，磷酸盐缓冲液 (PBS)为实验室自配，流式细胞仪为美国BD公司产品(型号FACSCalibur)。

　　1.3　检测方法

　　抽取静脉血1 ml，乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝。取流式专用试管2支，分别标记为正常对照管和测定管。正常对照管中加入CD3-PC5 10 μl，CD4-FITC、IgG1-PE各20 μl。测定管中加入CD3-PC5 10 μl，CD4-FITC、CD25-PE各20 μl。然后分别加入标本各100 μl，混匀，室温避光20 min。两管分别加溶血素50 μl，混匀，室温避光10 min。加纯净水500 μl混匀，室温避光10 min。加PBS 3 ml。离心：1 500 r/min，离心5 min。弃上清，留沉淀，混悬。上机：采用Cellquest软件进行上样，并用该软件自动统计结果。

　　1.4　统计学分析

　　计量资料以x-±s表示，采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

　　2　结果

　　2.1　ITP患者治疗前后外周血免疫表型分析

　　治疗前ITP患者外周血T细胞亚群分析其CD+4T细胞、CD+4CD+25T细胞、CD+4CD+25/CD+4T细胞均显著低于正常对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。CD3阳性T细胞2组比较差异无统计学意义(P>0.05)。治疗1个月、3个月、6个月与治疗前比较，治疗后中位PLT数显著升高，差异有统计学意义(P<0.05)。治疗后1个月、3个月、6个月与治疗前比较CD+4T细胞、CD+4CD+25T细胞、CD+4CD+25/ CD+4均明显升高，与治疗前比较差异有统计学意义(P<0.05)，与正常对照组比较差异均无统计学意义(P>0.05)。　ITP患者治疗前后外周血T细胞亚群检测

　　2.2　不同疗效的ITP患者CD+4、CD+25Tr比较

　　ITP治疗疗效按第二届全国血液学学术会议拟定的ITP疗效标准[2]。治疗后患者按疗效分为2组，显效及良效组的CD+4CD+25T细胞较进步及无效组高，但差异无统计学意义(P>0.05)。2例患者经治疗后血小板计数已达完全缓解，但CD+4CD+25T细胞比例仍较低，分别于治疗第3、4个月时复发。　不同疗效的ITP患者CD+4CD+25Tr比较

　　2.3　AIHA患者治疗前后外周血免疫表型分析

　　治疗前AIHA患者CD+4T细胞、CD+4CD+25T细胞、CD+4CD+25/CD+4T细胞均显著低于正常对照组(P<0.05)。CD3阳性T细胞2组比较差异无统计学意义(P>0.05)。治疗1个月、3个月、6个月与治疗前比较，红细胞、血红蛋白显著升高，网织红细胞显著降低(P<0.05)。治疗后1个月、3个月、6个月与治疗前比较CD+4T细胞、CD+4CD+25T细胞、CD+4CD+25/ CD+4均明显升高(P<0.05)，与正常对照组比较差异均无统计学意义(P>0.05)。见表3。AIHA疗效评价按国内标准[2]，完全缓解组的CD+4CD+25T细胞较部分缓解和无效组高，但差异无统计学意义(P>0.05)。　AIHA患者治疗前后外周血T细胞亚群检测　不同疗效AIHA患者CD+4CD+25Tr比较

　　3　讨论

　　ITP以往认为是由于抗血小板自身抗体导致血小板破坏增加所致。AIHA通常认为系免疫功能调节紊乱，自身抗体吸附于红细胞表面而引起的一种溶血性贫血，抗人球蛋白试验(Coombs试验)大多阳性。然而，越来越多的资料显示，除体液免疫外，细胞免疫在这两种病的发病中起着非常重要的作用。Chen等[3]研究发现急性ITP患儿外周血中CD+4CD+25T辅助细胞数量减少，白介素-10(IL-10)、人转化生长因子-β(TGF-β)含量也降低，CD+4CD+25T辅助细胞占CD+4细胞的比例与IL-10、TGF-β的含量均呈正相关。CD+4CD+25T辅助细胞活化后分泌大量的IL-10、TGF-β等抑制性细胞因子，其功能通过这些抑制性细胞因子来实现。因此推测可能由于ITP患儿外周血中CD+4CD+25T辅助细胞数量减少，有效的免疫抑制作用降低，导致自身反应性T细胞激活增多、凋亡减少，促进了血小板的破坏。调节性T细胞在AIHA发病中的作用逐渐被人们所认识。据统计大约25%的清除CD25的小鼠发生自身免疫性疾病，包括自身免疫性溶血性贫血[4]。在应用红细胞免疫小鼠前应用CD25单抗使CD+4CD+25T调节细胞耗竭，应用红细胞免疫CD+4CD+25细胞耗竭的小鼠使AIHA的发生率上升到90%，证实CD+4CD+25T辅助细胞与AIHA的发生有密切联系。而输注其它抗体然后给予红细胞免疫小鼠或单独给予CD25抗体不导致AIHA发生率增高[5]。本研究的结果与上述研究的结果相符。本研究组治疗3个月后随诊的患者，2例ITP患者治疗后外周血象达完全缓解，但CD+4CD+25T细胞比例仍较低，分别于治疗第3、4个月时激素减量过程中复发，而CD+4CD+25T细胞治疗后升高的患者，仅1例复发。提示CD+4CD+25T细胞在本病的复发中占有重要地位。

　　总之，ITP、AIHA患者治疗前CD+4CD+25Treg细胞显著低于正常对照组，治疗有效患者明显升高。以上说明CD+4CD+25Treg细胞减低与ITP、AIHA的发生、复发有密切联系。对该细胞的深入研究，将会进一步揭示ITP、AIHA的发病机制，为临床诊断、治疗与预防提供重要的理论依据。

　　【参考文献】

　　1　卢剑，沈立松.CD+4CD+25调节性T细胞参与肿瘤免疫的分子机制及临床应用展望.检验医学，2007,22：505-506.

　　2　张之南，沈悌主编.血液病诊断及疗效标准.第3版.北京：科学出版社，2007.19-23,68-70,157-162,172-175.

　　3　Chen X，Oppenheim JJ，Winkler-Pickett RT，et al.Glucocorlicoid amplifies IL-2-dependent expansion of functional FoxP+3CD+4CD+25T regulatory cells in vivo and enhances their capacity to suppress EAE.Eur J Immunol,2006,36：2139-2149.

　　4　Willerford DM，Chen J，Ferry JA，et al.Interleukin-2 receptor alpha chain regulates the size and content of the peripheral lymphoid compartment.Immunity,1995,3：521-530.

　　5　Mqadmi A，Zheng X，Yazdanbakhsh K.CD+4CD+25 regulatory T cells control induction of autoimmune hemolytic anemia.Blood,2005,105：3746-3748.