白细胞介素8和载脂蛋白E基因多态性与迟发性阿尔茨海默病的相关分析

　　作者：麦以成1,罗有年1,顾鸿1　　作者单位：1. 广东省佛山市顺德区伍仲珮纪念医院， 广东 佛山 528333; 2. 广州市脑科医院， 广东 广州 510370;3. 广东省佛山市第三人民医院， 广东 佛山 528000; 4. 广东省佛山市顺德区颐养院， 广东 佛山 528300)

　　【摘要】【目的】 探讨白细胞介素8基因(interleukin-8，IL-8)基因A-251T和载脂蛋白E(ApoE)基因多态性与迟发性阿尔茨海默病(LOAD)的相关性。【方法】 采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性方法(PCR-RFLP)观察185例广东汉族人群 (研究组：LOAD患者88例，正常对照组97例) IL-8基因A-251T基因、ApoE基因多态性的分布并进行关联分析。【结果】 ① IL-8 基因A-251T各基因型及等位基因在研究组及对照组间的差异均无统计学意义。② ApoE ε4等位基因频率在研究组中高于对照组，差异有统计学意义，为LOAD的患病危险因素(OR = 2.272， P = 0.003)。③ 按是否携带ApoE ε4等位基因将研究组和对照组均分为携带ε4组与非携带ε4组。无论是否携带ApoE ε4等位基因，IL-8 基因A-251T各基因型频率在研究组和对照组间无统计学差异(携带ε4组：P = 0.965;非携带ε4组：P = 0.523)。 【结论】　IL-8 基因A-251T多态可能与LOAD无关，与ApoE ε4可能不存在相互作用。

　　【关键词】 白介素8; 载脂蛋白E; 阿尔茨海默病; 基因; 多态性

　　Abstract： 【Objective】 To investigate the relation among the polymorphism of interleukin-8 (IL-8) gene A-251T and apolipoprotein E (ApoE) gene with late-onset Alzheimer’s disease (LOAD). 【Methods】 Polymerase chain reaction and restrictive fragment length polymorphism (PCR-RFLP) were used to detect the polymorphism distribution of IL-8 gene A-251T and ApoE gene of 185 people in Han ethnicity of Guangdong province (study group： 88 LOAD patients， controlled group： 97 people). The correlation of these genes was analyzed. 【Results】 (1) The differences of genotypes and alleles of IL-8 gene A-251T between study group and controlled group had no statistical significance. (2) The frequency of ApoE ε4 allele in study group was significantly higher than that in controlled group， as risk factor of LOAD (OR = 2.272， P = 0.003). (3) Study group and controlled group were both divided into two groups by carrying ApoE ε4 allele or not. The differences of IL-8 genotypes were no significant whether in carrying ApoE ε4 allele group or not (carrying ε4 group： P = 0.965; no carrying ε4 group： P = 0.523). 【Conclusion】 It is suggested that IL-8 gene A-251T polymorphism perhaps has no relation with LOAD and has no interaction with ApoE ε4 allele.

　　Key words： interleukin-8; apolipoprotein E; Alzheimer’s disease; gene; polymorphism

　　阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是一类最常见的老年人神经退行性变性疾病，根据发病年龄分为：早发性阿尔茨海默病，发病年龄早于65岁;迟发性阿尔茨海默病(late-onset Alzheimer’s disease，LOAD)，发病年龄晚于65岁。目前，AD病因未明，但遗传因素与炎症反应在该病的病理生理机制中发挥重要作用。研究表明老年斑中IL-1、IL-8等炎症标记物的表达明显增加[1]，IL-1和IL-6基因多态性可能与AD存在关联[2-4]，至今暂未见IL-8基因多态性与AD关联的报道。故本文检测了IL-8基因A-251T多态及ApoE基因多态在广东地区老年人中的分布，旨探讨其与LOAD的关系。

　　1 材料与方法

　　1.1 研究对象

　　研究组：共88例，均来自2005年1月至12月在广东省佛山市顺德区伍仲珮纪念医院及广东省佛山市第三人民医院住院部，符合《美国精神障碍诊断和统计手册(第四版)》(DSM-Ⅳ)中LOAD诊断标准，排除其他严重器质性疾病及任一精神疾病。其中男35例，女53例;平均年龄(79.6 ± 9.2)岁;MMSE评分为10.26 ± 7.94;ADL评分为60.7 ± 16.8。

　　正常对照组：共97例，均来自广东省佛山市顺德区颐养院，排除严重器质性疾病及任一精神疾病。其中男38例，女59例;平均年龄(79.7 ± 8.6)岁; MMSE评分为25.08 ± 3.41;ADL评分为27.7 ± 7.0。

　　所有研究对象均为汉族老年人，相互间无血缘关系，均知情同意。两组间性别、年龄及文化程度的差异均无统计学意义。

　　1.2 研究方法

　　1.2.1 基因提取 取外周静脉血5 mL，ACD抗凝，采用常规酚-氯仿抽提法提取基因组DNA。

　　1.2.2 IL-8基因A-251T多态性检测 引物序列[5]：上游引物：5′-CTTATCTTCACCATCATGATAGCAT CTG-3′;下游引物：5′-GGCTGCCAAGAGAGCCA CGGCCAGC-3′。聚合酶链反应体系总体积共25 μL，含100 ng基因组DNA，0.2 mmol/L dNTPs， 10 pmol/L引物，1 × PCR缓冲液，0.2 U Taq酶。扩增反应条件：95 ℃预变性5 min，循环条件为95 ℃ 30 s，64 ℃ 30 s，72 ℃ 50 s，共35个循环，最后72 ℃延伸7 min。在PCR产物中加入5 μL酶及酶切缓冲液体系中(含5 U MfeⅠ内切酶)，37 ℃酶切过夜，用8%聚丙烯酰胺电泳读取基因型。共分3种基因型T/T(突变型)：585 bp;A/T(杂合型)：585 bp， 414 bp， 171 bp; A/A(野生型)：414 bp，171 bp(图1)。

　　1.2.3 ApoE基因多态性检测 引物序列[6]：上游引物：5′-AACAACTGACCCCGGTGGCG-3′;下游引物：5′-ATGGCGCTGAGGCCGCGCTC-3′。聚合酶链反应体系总体积共25 μL，含200 ng DNA，1.5 μL 25 mmol/L MgCI2，1 μL 2.5 mmol/L dNTPs， 2.5 μL 10 × buffer， 6.4 pmol/L Primer(each)， 0.5 μL 5 U/μL TaqE， 2.5 μL DMSO。扩增反应条件：96 ℃ 5 min后进入循环，30个循环(94 ℃ 1 min，63 ℃ 50 s，72 ℃ 60 S)，72 ℃ 10 min。取PCR产物(292 bp) 10 μL，加5 U HhaⅠ内切酶 5 h，12%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离酶切产物，读取基因型。共分6种基因型，ε3/4型：91 bp，72 bp，48 bp，38 bp，35 bp;ε3/3型：91 bp，48 bp，38 p，35 bp;ε2/4型：91 bp，83 bp，72 bp，48 bp，38 bp，35 bp;ε2/3型：91 bp，83 bp，48 bp，38 bp，35 bp;ε2/2型：91 bp，83 bp，38 bp;ε4/4型：72 bp，48 bp，38 bp，35 bp。

　　1.3 统计学方法

　　用直接计数法计算等位基因及基因型频率。用HWE软件(J.Ott，1988)对基因型进行Hardy-Weinberg平衡估计。其他统计分析用SPSS10.0软件完成。两组间比较采用t检验，构成比比较采用χ2检验。

　　2 结 果

　　2.1 各基因型Hardy-Weinberg平衡定律吻合度检测

　　经吻合度检验，IL-8基因A-251T及ApoE基因各基因型均符合Hardy-Weinberg平衡定律(P均 > 0.05)。

　　2.2 IL-8基因A-251T各基因型及等位基因分布

　　经χ2检验，IL-8 基因A-251T各基因型频率在研究组和对照组间无统计学差异(χ2 = 0.762， P = 0.144)，各等位基因频率在两组间亦无统计学差异(χ2 = 0.039， P = 0.994)。

　　2.3 ApoE基因各基因型及等位基因频率分布

　　经χ2检验，ε4等位基因频率在研究组中为18.8%，高于对照组(8.2%)，差异有统计学意义，为LOAD的患病危险因素(OR = 2.272，χ2 = 8.859，P = 0.003);其余各基因型及等位基因在两组间的分布均无统计学差异(P均 > 0.05，表2)。

　　2.4 IL-8基因和ApoE基因的关系

　　按是否携带ApoEε4等位基因将研究组和对照组均分为携带ε4组与非携带ε4组。经χ2检验，结果表明无论是否携带ApoEε4等位基因，IL-8 基因A-251T各基因型频率在研究组和对照组间无统计学差异(携带ε4组：χ2 = 0.072， P = 0.965;非携带ε4组：χ2 = 1.296， P = 0.523，表3)。

　　3 讨 论

　　3.1 ApoE基因与LOAD

　　本研究表明ApoE ε4等位基因的分布在研究组中显著高于对照组，为LOAD的患病危险因素，这与国内外报道一致[7]。自首次提出ApoE ε4是LOAD的易感基因以来，国外群体研究和连锁分析均证实该等位基因是AD的遗传易感基因，并与其他一些AD易感基因存在相互作用。目前ApoE ε4已成为AD分子遗传研究中的基本参量[6]，故本研究选择该基因多态对IL-8 基因A-251T多态做参照。

　　3.2 IL-8基因A-251T与LOAD、ApoE基因

　　流行病学研究表明多种环境因素与遗传因素与AD有关，其中氧化损伤与炎性反应越来越受到关注。IL-8是一种作用广泛的炎症因子，IL-8与位于中性粒细胞表面的IL-8受体结合后，可激活中性粒细胞，促使其分泌大量细胞因子，进一步扩大炎症反应，释放胞内酶及其活性，产生大量氧自由基。研究表明[1]，AD患者老年斑中β淀粉蛋白周围小胶质细胞较集中，且IL-8、IL-1等炎性标记物的表达持续增加，IL-8可增至正常情况下的11.7倍，这提示IL-8可能在AD病因中起发挥一定作用。

　　IL-8基因位于染色体4q12-21，全长5.1 kb，有3个内含子和4个外显子。其转录起始点上游-251处存在A/T多态，通过转录调控影响IL-8的合成，且A等位基因与高IL-8水平相关[8-9]。暂未见IL-8基因A-251T与LOAD的研究。

　　本研究表明，研究组与对照组的T等位基因频率均为67%，与日本人60.5%相近，较北爱尔兰人[10]57%稍高，比曾至荣[9]报道的中国陕西人群53.4%高，提示该基因多态分布可能存在种族及地域差异。但IL-8基因A-251T各基因型及等位基因在研究组及对照组间不存在统计学差异;为进一步验证其与LOAD的关系，按是否携带ApoEε4等位基因将研究组和对照组分层，结果仍表明无论是否携带ApoEε4等位基因，该基因多态在两组间无统计学差异。提示该基因多态可能与LOAD无关，与ApoE ε4可能不存在相互作用。其原因可能有以下方面：①IL-8 基因A-251T多态与LOAD的关联较弱，在样本量偏小的研究中难以发现;②研究对象不同的遗传背景及不同的环境与遗传的相互作用也可能导致研究结果的不同;③ApoE基因可能在LOAD的病理生理过程中发挥更为重要的作用，研究时多种基因间的相互作用也可能导致不同的结果。

　　本研究首次探讨了IL-8 基因A-251T、ApoE基因与LOAD的关系，但样本量偏小，研究基因数量有限，故有待在以后的研究中结合其他易感基因、环境因素及扩大样本进一步检验和探索。

　　【参考文献】

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　　3 Papassotiropoulos A， Bagli M， Jessen F， et al. A genetic variation of the inflammatory cytokine interleukin-6 delays the initial onset and reduces the risk for sporadic Alzheimer’s disease [J]. Ann Neurol， 1999，45(5)：666-668.

　　4 林英堂，李龙宣. 丹参酮对阿尔茨海默病样大鼠海马内IL-1β、IL-6 mRNA以及一氧化氮合酶表达的影响 [J]. 中山大学学报：医学科学版，2005，26(B03)： 20-23.

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　　9 曾志荣，周韶璋，廖山婴，等. 白介素8-251位点基因多态性与我国高低发区胃癌关系 [J]. 中山大学学报：医学科学版，2005，26(5)：537-540.

　　10 Ross OA， O’Neill C， Rea IM， et al. Functional promoter region polymorphism of the proinflammatory chemokine IL-8 gene associates with Parkinson’s disease in the Irish [J]， 2004，65(4)：340-346.