重组人肿瘤坏死因子-α体内外对HL-60细胞作用的研究

　　作者：刘霞,陈元仲,吴勇,黄美娟,杨大柳　　作者单位：福建医科大学附属协和医院 福建省血液病研究所，福州 350001

　　【摘要】为了研究重组人肿瘤坏死因子-α(recombinant human tumor necrosis factor-alpha，rhTNF-α)在体外及体内对人髓系白血病细胞株HL-60细胞的作用，应用MTT法和集落形成试验测定HL-60细胞的增殖抑制，采用AO/EB荧光染色法、流式细胞术和TdT酶介导的缺口末端标记(TUNEL)法检测凋亡细胞;利用HL-60细胞裸鼠异种移植瘤模型观察给药后瘤体重量、组织病理的改变，并采用透射电镜以及TUNEL法检测瘤组织细胞的凋亡。结果表明： rhTNF-α对HL-60细胞的增殖具有明显的抑制作用，呈时间和浓度依赖性;AO/EB染色后可见rhTNF-α处理组HL-60细胞核内染色质浓缩聚集或成碎片，呈现凋亡表象;流式细胞术显示随着rhTNF-α浓度的增加，细胞凋亡阳性率逐渐增高;TUNEL法检测显示，3 200 U/ml rhTNF-α作用于HL-60细胞48小时凋亡阳性率可达37.5%。在体内，rhTNF-α可抑制HL-60细胞裸鼠异种移植瘤生长，抑制率最高可达60.33%;病理检查发现，rhTNF-α处理组的瘤组织有程度不等的出血坏死区域;透射电镜及TUNEL法检测表明，处理组的瘤组织可见有较多凋亡细胞。结论：rhTNF-α在体内、外均可抑制HL-60细胞增殖，并诱导其凋亡。

　　【关键词】 重组人肿瘤坏死因子

　　Abstract To study the effects of recombinant human tumor necrosis factor-alpha ( rhTNF-α) on HL-60 cells in vitro and in vivo，MTT and colony forming assay were used to examine the effects of rhTNF-α on proliferation of HL-60 cells; AO/EB (acridine orange - ethidium bromide) staining，Annexin -V flow cytometry analysis and TUNEL assay were used to detect apoptotic cells .The effect of rhTNF-α on xenograft growth of HL-60 cells was evaluated by tumor inhibition rate，histology，ultrastructure and TUNEL assay. The results showed that rhTNF-α inhibited the proliferation of HL-60 cells in a dose-dependent manner. Staining of cells with AO/EB revealed that rhTNF-α induced nuclear chromatin condensation and fragmentation . Positive Annexin V -FITC on cell membrane showed that rhTNF-α induced apoptosis of HL-60 cells in a dose-dependent manner. TUNEL assay showed that the apoptotic percentage of HL-60 cells reached 37.5% when incubated with 3200 U/ml rhTNF-α for 48 hours. In vivo rhTNF-α inhibited xenograft growth of HL-60 cells with the highest inhibition rate of 60.33%. Pathologically it was found that there were necrotic areas in the tumors of groups treated with rhTNF-α. There were more apoptotic cells in treatment groups than in that control group by transmission electron microscopy (TEM) and TUNEL assay. It is concluded that rhTNF-α is able to inhibit the proliferation of HL-60 cells and to induce apoptosis of HL-60 cells in vitro and in vivo.

　　Key words rhTNF-α; HL-60 cells; Proliferation; Apoptosis

　　肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-alpha，TNF-α)是一种多效应的细胞因子，具有抗肿瘤、抗感染和调节机体免疫等功能，其抗肿瘤作用一直备受关注。有关TNF-α的抗肿瘤作用侧重于对黑色素瘤、肺癌、肝癌、鼻咽癌、喉癌等，而对白血病的作用研究较少。我们前期的研究发现，在三氧化二砷(As2O3)诱导HL-60细胞凋亡过程中伴有内源性TNF-α表达增强，而TNF-α反义硫代磷酸寡脱氧核苷酸能够抑制As2O3诱导细胞凋亡[1]，提示内源性TNF-α在HL-60细胞凋亡过程中的起驱动作用。已知外源性TNF-α在体外可以诱导HL-60细胞凋亡[2]，而其在体内对HL-60细胞的作用，目前仍未见有报道。本实验采用重组人肿瘤坏死因子-α(rhTNF-α)，研究其在体外对HL-60细胞的作用，进一步通过HL-60细胞裸鼠移植瘤模型，研究其在体内对HL-60细胞裸鼠移植瘤的作用。

　　材料和方法

　　细胞培养

　　人髓系白血病细胞株HL-60，由武汉中国典型培养物保藏中心引进。置于含10%的胎牛血清(杭州四季青生物制品研究所)的RPMI 1640(Gibco-BRL)培养液中，在37℃、饱和湿度、5%的CO2培养箱中培养。

　　药物和动物

　　rhTNF-α由厦门特宝生物工程有限公司馈赠，1 mg比活性不低于2×107 U，-20℃冰箱保存。6-8周龄的BABL/c裸鼠，体重16-18克。由中国医学科学院上海实验动物繁育中心提供，为无特殊致病菌(SPF)动物，合格证号为SCXX(沪)2003-0003。裸鼠在SPF层流柜中饲养。

　　细胞活力的MTT法测定

　　取96孔培养板若干，每孔接种HL-60细胞100 μl(密度为1×105/ml)，然后加入用RPMI 1640培养液稀释的不同浓度的rhTNF-α，使rhTNF-α终浓度分别为3 200、1 600、800、400、200、100、50、25和0 U/ml，每组设4个平行孔，分别培养24、48、72和96小时，按照徐承熊[3] 的方法进行检测。

　　集落形成试验

　　培养体系的总体积为1 ml，其中含10%胎牛血清、0.8%甲基纤维素的RPMI 1640培养液。实验组rhTNF-α终浓度分别为100 、200 和400 U/ml，对照组加RPMI 1640，HL-60细胞终浓度为4×102/ml，种于24孔板，每组设3个平行孔。培养7天后，计数集落数目。大于或等于20个细胞组成的细胞群为1个白血病细胞集落。集落形成抑制率(%)=(1-实验组集落数/对照组集落数)×100% 。

　　细胞凋亡的检测

　　分别收集800、1 600和3 200 U/ml rhTNF-α作用48小时后的HL-60细胞，采用AO/EB荧光染色法、流式细胞术(Annexin V-FITC试剂盒，Becton Dickinson公司)、TdT酶介导的缺口末端标记(TUNEL试剂盒，Promega公司)法检测细胞凋亡。详细方法根据相应试剂盒中的说明书进行。

　　rhTNF-α对HL-60荷瘤裸鼠体内抗白血病作用的测定

　　收集对数生长期的HL-60细胞，在每只裸鼠右后背侧皮下接种0.2 ml细胞悬液(2.5×106个细胞 /只)，选择肿瘤的直径为0.5-0.6 cm的裸鼠随机分为高(G1)、中(G2)、低(G3)3个浓度组和生理盐水对照(G0)组，每组7只裸鼠。高、中、低浓度组分别按每只每次瘤内注射rhTNF-α 2.0×104 U/0.2 ml、1.0×104 U/0.2 ml 、0.5×104 U/0.2 ml进行治疗，对照组注射等量生理盐水。每天给药1次，连续7天。末次给药后24小时，取出实验裸鼠，颈椎脱臼处死，完整剥离瘤块称重，计算抑瘤率并行HE染色作病理检查。抑瘤率(%)=(1-实验组平均瘤重/对照组平均瘤重) ×100%。采用透射电镜观察瘤组织超微结构、用TUNEL法检测瘤组织中细胞凋亡。

　　统计学分析

　　采用SPSS 11.5 for windows 软件包进行单因素方差分析。

　　结果

　　rhTNF-α对HL-60细胞增殖的抑制作用

　　不同浓度rhTNF-α及不同处理时间对HL-60细胞增殖均有明显抑制作用，且呈时间、浓度依赖关系(图1)。rhTNF-α对HL-60细胞集落形成亦具有明显抑制作用。

　　rhTNF-α诱导HL-60细胞凋亡的作用

　　AO/EB复合染色结果显示：HL-60细胞经rhTNF-α处理48小时，细胞大小、形态呈不均一性，可见凋亡细胞，胞核或胞浆呈致密浓染或碎片黄绿色荧光，同时偶见坏死细胞，胞核呈红色荧光。流式细胞仪检测发现，rhTNF-α能诱导HL-60细胞凋亡，并呈浓度依赖性。TUNEL法检测发现rhTNF-α 800、1 600和3 200 U/ml分别作用HL-60细胞48小时，各组凋亡阳性率依次为15.0% 、22.5%、37.5%，而对照组HL-60细胞均未见或偶见阳性细胞。

　　rhTNF-α对HL-60细胞裸鼠移植瘤的作用

　　rhTNF-α对裸鼠移植瘤生长的抑制作用

　　对HL-60细胞裸鼠移植瘤行瘤内注射rhTNF-α，瘤内注射rhTNF-α 1.0×104单位/只和 2.0×104单位/只时，其对移植瘤的抑制率分别为55.21%(P<0.05)和60.33%(P<0.01)。但采用低浓度(0.5×104单位/只)时，其对移植瘤的抑制率仅为17.36%(P>0.05)。此结果说明实验中的高、中浓度rhTNF-α对HL-60细胞株裸鼠异种移植瘤的生长具有抑制作用。

　　rhTNF-α对HL-60细胞裸鼠移植瘤组织病理结构的影响

　　肉眼观察rhTNF-α各处理组瘤块可见出血坏死区域，程度不等，有的瘤块表面可见黑色痂样改变。低倍镜下观察对照组瘤组织内有散在的局灶性细胞坏死区域，rhTNF-α各处理组瘤组织有成片不规则坏死、出血改变，呈片状的嗜伊红结构，其中以高浓度组和中浓度组为甚。

　　rhTNF-α对HL-60细胞裸鼠移植瘤细胞凋亡的诱导作用

　　透射电镜观察显示： rhTNF-α处理组瘤组织中出现各阶段的凋亡细胞及坏死细胞，胞浆内线粒体肿胀，核染色质固缩、聚集于核膜下、呈境界分明的颗粒块状或新月形小体;对照组HL-60细胞形态正常。TUNEL法检测发现，在光学显微镜下rhTNF-α处理组的瘤组织切片中可见较多棕褐色的凋亡细胞，对照组则少见凋亡细胞。

　　讨 论

　　TNF-α在诱导肿瘤细胞凋亡中起重要作用，van-de-Loosdrecht等[4]体外实验研究表明，104 U/ml TNF-α可诱导U937细胞凋亡; Katschinski等[5]研究发现，高温(42℃)诱导人类髓系白血病细胞PLB-985发生凋亡过程中伴有TNF-α mRNA表达和TNF-α蛋白分泌显著增强;我们前期的研究发现，内源性TNF-α在HL-60细胞凋亡过程中起驱动作用[1]，亦有研究表明外源性TNF-α在体外可以诱导HL-60细胞凋亡[2];但尚未见以白血病细胞裸鼠移植瘤为模型来研究rhTNF-α体内抗白血病作用的报道。本研究在体外实验的基础上，利用裸鼠异种移植瘤模型，对rhTNF-α的体内、外抗白血病作用进行了研究，实验结果显示，rhTNF-α对体外培养的HL-60细胞的增殖具有明显的抑制作用，且这种作用呈时间和浓度依赖性，并可诱导其凋亡;同时发现rhTNF-α可抑制HL-60细胞裸鼠异种移植瘤的生长，瘤组织病理检查证实治疗组瘤细胞坏死明显，进一步采用电子显微镜及TUNEL法对瘤组织进行检测发现，治疗组可见较多凋亡细胞，而对照组少见。这些结果提示rhTNF-α在体内亦可诱导HL-60细胞凋亡。

　　本实验中，rhTNF-α组移植瘤出现坏死表现，病理检查显示给药组瘤细胞变性坏死较对照组显著，瘤细胞数目明显减少;电子显微镜观察显示，在rhTNF-α处理组坏死细胞亦较对照组多。这提示rhTNF-α一方面可诱导肿瘤细胞凋亡，另一方面可促进肿瘤细胞的坏死。它通过诱导上述两种形式的细胞死亡发挥其抗肿瘤作用，其具体的调节机制有待进一步研究。

　　【参考文献】

　　1陈元仲，吴勇，黄美娟等. 内源性TGF-β1、TNF-α在三氧化二砷诱导HL-60细胞凋亡中作用的研究.中华血液学杂志，2003;24:231-234.

　　2Kumakura S，Ishikura H，Tsumura H，et al. C-myc and Bcl-2 protein expression during the induction of apoptosis and differentiation in TNF alpha-treated HL-60cells. Leuk Lymphoma，1996; 23:383-394

　　3徐承熊. MTT法测定药物对癌细胞杀伤作用的选择. 见:韩锐.抗癌药物研究与实验技术. 北京:北京医科大学中国协和医科大学联合出版社.1996:284-286

　　4van-de-Loosdrecht AA，Ossenkoppele GJ，Beelen RH，et al. Apoptosis in tumor necrosis factor-alpha-dependent，monocyte-mediated leukemic cell death: a functional，morphologic，and flow- cytometric analysis. Exp Hematol，1993; 21:1628-1639

　　5Katschinski DM，Robins HI，Schad M，et al. Role of tumor necrosis factor alpha in hyperthermia-induced apoptosis of human leukemia cells. Cancer Res，1999; 59:3404-3410