Toll样受体在U937细胞的表达及其作用研究

　　作者：熊芳,王兴兵,张佳华,刘伟,孙思　　作者单位：华中科技大学同济医学院附属协和医院干细胞研究中心, 武汉 430022;　1安徽医科大学附属安徽省立医院血液科，合肥 230001

　　【摘要】本研究探讨急性髓系白血病的免疫治疗中以Toll样受体(TLRs)为靶点的可能性，研究人急性髓系白血病U937细胞TLR的表达及TLR 8受体激动剂ssRNA40/LyoVec对其增殖、凋亡和细胞周期的影响。运用逆转录聚合酶链反应(RTPCR)检测U937细胞TLR 1-9 mRNA的表达，用流式细胞术检测TLR 8的表达。 用不同浓度的TLR 8激动剂ssRNA40/LyoVec作用于体外培养的U937细胞后，采用CCK8法检测细胞生长抑制率，流式细胞术检测细胞凋亡和细胞周期。 结果表明： U937细胞表达TLR 1-9，TLR 8激动剂ssRNA40/LyoVec作用于U937细胞明显地抑制了U937细胞生长，抑制率可达70%，且呈明显的量效关系;作用后处于G0/G1期细胞比例由(44.67±1.05)%增高到(54.08±1.19)%，但凋亡细胞的比例无明显变化。 结论： TLR 1-9可在U937细胞中表达，TLR 8激动剂ssRNA40/LyoVec具有抗肿瘤细胞增殖的作用，使细胞阻滞在G0/G1期，但无明显的促凋亡作用。

　　【关键词】 Toll样受体 TLR 8激动剂 U937细胞 ssRNA40/LyoVec

　　Abstract The aim of study was to explore the potential application of targeting at Tolllike receptors (TLRs) in the immunotherapy of acute myelocytic leukemia, and to investigate the expression of TLR and the effects of TLR 8 agonist ssRNA40/LyoVec on proliferation, apoptosis and cell cycle of U937 cells. The expression of TLR 1-9 in U937 cells was detected by using reverse transcription polymerase chain reaction (RTPCR) and the expression of TLR 8 was assayed by flow cytometry (FCM). The effect of TLR 8 agonist, ssRNA40/LyoVec, at different concentrations on U937 cells proliferation was evaluated by CCK8, apoptosis and cell cycle were detected by FCM. The results showed that U937 cells expressed TLR 1-9. TLR 8 agonist ssRNA40/LyoVec could inhibit the growth of U937 cells both in timeand dosedependent manner and the inhibitory rate could reach 70%. It also increased the percentage of cells in G0/G1 phase. There was no significant difference in percentage of apoptotic cells between control and treated groups. It is concluded that TLRs including TLR 1-9 express on U937 cells and TLR 8 agonist ssRNA40/LyoVec may be able to inhibit the growth of U937 cells， arrest the cells in G0/G1 phase, but have no effect of promoting apoptosis.

　　Key words Tolllike receptor; TLR 8 agonist; U937 cell; ssRNA40/LyoVec

　　Toll样受体(Tolllike receptors, TLRs)是一类新近发现的能识别微生物，特别是细菌和病毒的模式识别受体(pattern recognition receptor, PRR), 介导天然免疫反应并桥接或触发适应性免疫[1]。TLR可在各种肿瘤细胞中表达，参与肿瘤免疫监视，并对肿瘤的生长发挥不同的作用。对急性髓系白血病中TLRs的表达及作用，目前尚无报道。此外，某些TLR激动剂已作为免疫佐剂用于抗肿瘤免疫治疗中[2]。我们的前期研究表明，CD4+CD25high调节性T细胞比例的升高是急性髓系白血病免疫功能受损的一个重要机制[3]。最近的研究发现，TLR 8激动剂可有效的阻断调节性T细胞的免疫抑制作用而加强抗肿瘤免疫[4], 提示利用TLR 8激动剂阻断调节性T细胞的功能可能是急性髓系白血病免疫治疗的一个重要靶点，但其对急性髓系白血病细胞的直接作用尚不清楚。本研究以急性髓系白血病细胞系U937细胞为研究对象，检测U937细胞各种TLR的表达并探讨TLR 8激动剂ssRNA40/LyoVec对其增殖、凋亡和周期的影响。

　　材料

　　TLR 8激动剂ssRNA40/LyoVec购自InvivoGen公司，溶解于无菌水，分装备用; TRIZOL提取RNA试剂盒购自美国Gibco/BRL公司;逆转录试剂盒购自美国Fermentas公司; PCR试剂盒购自上海生物工程公司; TLR 8FITC、同型对照IgG1FITC和破膜剂购自Imgenex公司;荧光标记抗Ⅴ型膜联蛋白(AnnexinV FITC)/ 碘化丙锭(PI)双标凋亡试剂盒购自深圳晶美生物工程有限公司;CCK8试剂盒购自日本同仁化学研究所; RPMI1640培养液和胎牛血清均为美国Hyclone公司产品。

　　细胞培养

　　人髓系白血病细胞U937细胞为本室保存。按常规方法用含10% 胎牛血清的RPMI1640培养液，在37℃、5% CO2、饱和湿度的孵箱中培养。每48小时换液传代1次。取处于对数生长期且细胞活性大于98%的细胞进行实验。

　　逆转录聚合酶链反应

　　TLR 1-9、βactin引物序列通过gene fisher软件设计, 并由上海生物工程公司合成 (表1)。总RNA采用TRIZOL试剂提取，以其为模板严格按照反转录试剂盒说明书要求逆转录合成 cDNA, 然后采用25 μl反应体系, 按以下条件对TLR 1-9及内参照βactin同时进行PCR扩增： 94℃预变性5分钟, 94℃ 30秒, 55℃ 30秒, 72℃ 30秒, 共35个循环，最后72℃延伸5分钟。反应完毕，取10 μl PCR产物在1.5%琼脂凝胶中进行电泳。电泳完毕后，在凝胶分析仪下进行观察并同时成像。

　　U937细胞胞内TLR 8表达的流式细胞术检测

　　收集至少2×105个U937细胞,分2管，PBS洗涤2遍，按说明书步骤破膜后， 1管加入2 μl TLR 8FITC，另1管加入同型对照IgG1FITC 5 μl ，4℃下避光孵育20分钟后，用FACS CaliberTM流式细胞仪检测，Cell Quest软件进行数据分析。

　　细胞增殖活性的CCK8试剂盒测定

　　调整细胞浓度为2×107/L。实验分为2组：阴性对照组和加药组，每组设3个平行孔。96孔培养板中每孔加入90 μl 细胞、10 μl药物或培养液，经 0.2 μg/ml 、1 μg/ml ssRNA40/LyoVec分别作用24、48和72小时后，终止培养。每孔加入CCK8 10 μl，37℃孵育3小时后，选择450 nm 波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔A值。

　　肿瘤细胞的生长抑制率(%)=[(对照组-给药组)/(对照组-本底)]×100%

　　细胞凋亡的流式细胞术测定

　　收集至少104个经1 μg/ml ssRNA40/LyoVec作用24、48和72小时后的细胞，离心弃去上清，用PBS洗涤2遍后, 重悬细胞, 加入5 μl AnnexinV 室温避光孵育10分钟后，用PBS洗1遍，加入10 μl碘化丙锭(PI)后上流式细胞仪检测。

　　细胞周期中细胞变化的流式细胞仪测定

　　收集至少104个经ssRNA40/LyoVec作用后的细胞,用PBS洗涤2遍, 加70%乙醇2 ml, 4℃固定12小 时以上。离心弃去上清,用PBS洗涤2遍后, 重悬细胞, 加入50 μl含0.1% Triton X100的碘化丙锭(PI), 4℃下避光孵育至少12小时后上流式细胞仪检测，分析细胞周期各时相所占百分率的变化。

　　统计学分析

　　全部数据均用采用SPSS 11.5统计学软件处理，组间均数比较采用t检验，多组间均数比较采用单因素方差分析，以P<0.05为差异具有显著性。

　　结 果

　　TLR 1-9在U937细胞的表达

　　经RTPCR检测在U937细胞有TLR 1-9 mRNA的转录，并用流式细胞术检测进一步证实了U937细胞胞内TLR8的表达。

　　TLR 8激动剂ssRNA40/LyoVec对U937细胞生长的抑制作用

　　TLR 8激动剂ssRNA40/LyoVec可抑制 U937细胞的生长，表现出剂量和时间依赖性。 0.2 μg/ml 、1 μg/ml TLR 8激动剂ssRNA40/LyoVec分别作用于U937细胞24、48和72小时后检测其增殖，结果24小时有抑制作用，48小时抑制作用增加，但72小时抑制作用无明显升高(图3)。当ssRNA40/LyoVec的浓度分别为0.2 μg/ml 和1 μg/ml时，对U937细胞增殖抑制具有显著性的差异(P<0.05) (表2)。 1 μg/ml TLR 8激动剂ssRNA40/LyoVec作用U937细胞72小时后, 流式细胞仪检测细胞凋亡的结果表明，对照组和加药组凋亡细胞率分别为2.26%， 4.27% ，两者比较无显著性差异(P>0.05)(图4)。

　　TLR 8激动剂ssRNA40/LyoVec作用后细胞周期的细胞变化

　　用1 μg/ml TLR 8激动剂ssRNA40/LyoVec作用于U937细胞72小时后进行流式细胞仪检测。结果表明，与对照组相比，增殖期的细胞(G0/G1)比例增多，差异有显著性意义 (P<0.05) (表3)， 但都未

　　Table 3. Effect of ssRNA40/LyoVec on cell cycle distribution of U937 cells(±SD， n=3)

　　GroupPercentage of U937 cells in different phasesG0/G1SG2/MControl44.67±1.0530.32±1.1125.01±0.95ssRNA40/LyoVec54.08±1.19*26.01±0.9819.91±0.56*P<0.05, compared with control group.

　　讨 论

　　Toll受体是最初在果蝇中发现的一种属于I型跨膜蛋白的受体。1997年在人类细胞表面发现了与Toll受体同源的分子，被称为Toll样受体(Tolllike receptor, TLR)。迄今，在人类已发现了11种TLR, 分别命名为TLR 1-11。TLR可表达于多种免疫细胞，其中主要表达于树突状细胞(DC)等抗原呈递细胞(APC)，也分布于淋巴细胞、NK细胞等，是天然免疫和适应性免疫的重要分子。最近的研究的表明，TLR也可分布于各种肿瘤细胞，如结肠癌、乳腺癌、前列腺癌细胞。在血液系统肿瘤的研究发现，TLR可表达于B系淋巴瘤细胞、B系慢性淋巴细胞白血病细胞和骨髓瘤细胞[5-8]。本研究中我们首次观察了TLR在急性髓系白血病细胞系U937细胞表达，发现TLR 1-9都在U937细胞表达。

　　我们原来的研究表明，急性髓系白血病(AML)患者体内CD4+CD25high调节性T细胞(Treg)升高，使得抗肿瘤免疫应答在一定程度上受损，它是肿瘤逃避机体免疫攻击的机制之一[3]。TLR也可表达Treg细胞上，主要是TLR 4，TLR 5，TLR 7，TLR 8。最近的研究表明，人类TLR 8的天然或合成的配体能逆转Treg细胞的免疫抑制作用[4]，进而增强抗瘤免疫功能，这提示TLR 8配体可能在AML病人的免疫治疗中具有重要作用。在血液系统肿瘤中，TLR 7/8激动剂可加强B系淋巴瘤细胞的免疫原性，减轻淋巴瘤的皮肤损害，在淋巴瘤的免疫治疗中可能发挥重要的作用;但另一反面在多发性骨髓瘤中大部分的TLRs促进骨髓瘤细胞的增殖和存活。因此，TLR 8配体对急性髓细胞白血病细胞的直接效应尚需进一步研究。本研究初次发现，急性髓系白血病细胞U937细胞表达TLR 8，且TLR 8受体激动剂ssRNA40/LyoVec能明显的抑制U937细胞的生长，并呈明显的量效关系和时间依赖性。1 μg/ml ssRNA40/LyoVec作用于U937细胞72小时，细胞生长抑制率可达到73%，可见TLR 8受体激动剂具有显著的抑制肿瘤细胞生长的作用。

　　TLR 8受体激动剂ssRNA40/LyoVec能明显的抑制U937的生长，但其机制尚不明。用CCK8方法分析细胞周期和细胞凋亡的结果表明，经1 μg/ml ssRNA40/LyoVec处理的U937细胞增殖受抑，流式细胞仪检测显示其主要停滞于G0/G1期，但并不能诱导U937细胞凋亡。TLR 8受体激动剂ssRNA40/LyoVec使细胞阻滞在G0/G1期，不能进入S期，细胞DNA合成受抑制，从而丧失增殖分裂的能力，可能是其抑制U937细胞生长的原因之一。同时G1期阻滞可能加强了细胞的修复能力，使进入凋亡途径的细胞相应减少，因此TLR 8受体激动剂没有促进U937细胞凋亡的作用。然而，TLR 8受体激动剂ssRNA40/LyoVec抑制U937细胞生长的具体的机制不明。最近的研究表明，TLR 8可负性调控小鼠神经元的轴突的生长，同时诱导神经元的凋亡，且抑制轴突生长和诱导神经元凋亡是由不同的信号通路介导的[9]。他们的实验还证实，对神经元轴突生长的抑制并不是因为诱导了神经元的凋亡。在小鼠中TLR 8不能活化NFκB，可能是经由MAPK/NFκB非依赖性通路抑制细胞的生长和诱导凋亡[9]。TLR 8受体激动剂对U937细胞增殖和凋亡的作用可能也存在相同的情况，他们可能由独立的信号通路所调控。具体的信号通路，是经由NFκB活化信号通路，还是经由MAPK/NFκB非依赖性信号通路还有待进一步研究。

　　总之，TLR 8受体激动剂ssRNA40/LyoVec可有效地抑制急性髓系白血病细胞U937细胞的增殖，加之其具有阻断CD4+CD25high调节性T细胞的免疫抑制的作用，提示ssRNA40/LyoVec可能在急性髓系白血病的免疫治疗中具有潜在的应用前景[10]，分析其确切作用机制将是进一步研究的重点。

　　【参考文献】

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　　3Wang X, Zheng J, Liu J, et al. Increased population of CD4(+)CD25(high) regulatory T cells with their higher apoptotic and proli ferating status in peripheral blood of acute myeloid leukemia patients. Eur J Haematol, 2005; 75:468-476

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　　8Bohnhorst J, Rasmussen T, Moen SH, et al. Tolllike receptors mediate proliferation and survival of multiple myeloma cells. Leukemia, 2006; 20:1138-1144

　　9Ma Y， Li J， Chiu I, et al. Tolllike receptor 8 functions as a negative regulator of neurite outgrowth and inducer of neuronal apoptosis. J Cell Biol, 2006; 175:209-215