TPA诱导K562细胞分化过程中线粒体铁蛋白表达情况研究

　　作者：孙蕾,高举,袁粒星,陈婷婷　,潘玲丽　　　作者单位：四川大学华西第二医院儿童血液科，成都 610041; 1四川大学华西第二医院妇幼医学实验中心，成都 610041

　　【摘要】为了研究K562白血病细胞在十四烷酰佛波醇乙酯(TPA)诱导分化过程中线粒体铁蛋白(MtF)、运铁蛋白受体Ⅰ(TfR1)和铁蛋白(Fn)mRNA表达水平的变化情况，并探讨MtF在白血病细胞增殖和细胞铁代谢方面的作用，采用TPA(终浓度16 nmol/L)诱导K562白血病细胞向单核细胞定向分化，并于诱导分化后第1、3和5天收集细胞，用瑞氏染色法观察各时点细胞形态，流式细胞术检测细胞表面分化抗原CD64的表达水平，使用半定量RTPCR方法检测各时点细胞MtF、TfR1和Fn mRNA表达水平，管家基因βactin用作对照。结果表明，TPA(16 nmol/L)可诱导K562细胞向单核细胞分化，细胞呈现单核细胞典型的形态学特征，在诱导培养第5天诱导分化率可达95%，细胞表面CD64表达水平显著增加。诱导分化前K562细胞具有一定水平MtF表达，但随着TPA诱导细胞分化的增强，MtF和TfR1 mRNA表达水平进行性下调，诱导分化第5天的表达水平分别为诱导分化前的50.3%和68.2%，而Fn mRNA表达水平则逐渐上调，诱导分化第5天表达水平为诱导分化前的1.97倍。结论： TPA诱导K562细胞向单核细胞分化过程中MtF和TfR1 mRNA表达下调，而Fn mRNA表达上调;这种协调变化有助于降低细胞通过TfR1介导的铁摄取，从而抑制或影响细胞增殖能力。

　　【关键词】 TPA; K562细胞; 线粒体铁蛋白; 运铁蛋白受体Ⅰ; 铁蛋白

　　Abstract Mitochondrial ferritin (MtF), a new player in iron metabolism, first identified in 2001, is highly homologous to ferritin both structurally and functionally. Preliminary studies have suggested that MtF might play very important roles in the regulation of mitochondrial iron homeostasis. Leukemic cells, just like other malignant cells, demand more iron for their greater proliferation potential. However, little is known about what roles MtF might play in leukemic cell iron metabolism and cell proliferation. The aim of this study was to investigate the expression of MtF, transferrin receptor 1 (TfR1) and ferritin (Fn) mRNAs in K562 leukemic cells during TPAinduced cell differentiation and to explore the interrelationship between the expression levels of these iron metabolismrelated molecules. K562 cells cultured with or without TPA (16 nmol/L) were collected at 24, 72 and 120 hours respectively. Cell differentiation toward monocyte lineage was confirmed by microscopic study (Wright's staining) and flow cytometry. Semiquantitative RTPCR was performed to determine mRNA expression, with housekeeping gene βactin as control reference. This study revealed that over 95% of K562 cells showed morphological features of monocyte/macrophage，and the expression of CD64 on cell surface increased significantly at day 5 with TPA treatment. K562 cells could express a certain level of MtF before TPAinduced differentiation. With increase of TPAinduced cell differentiation, MtF mRNA expressions were downregulated progressively. After 5 days of induced cell differentiation， expression levels of MtF and TfR1 mRNA were just 50.3% and 68.2% of that before TPA treatment. While Fn mRNA expression increased to 1.97 folds of that before TPA treatment. It is concluded that MtF expression is downregulated during TPAinduced K562 cell differentiation, with concomitant downregulation of TfR1 and upregulation of Fn. The coordinated expression regulation of these key iron metabolismrelated molecules during cell differentiation may in turn inhibit TfR1mediated iron uptake via endocytosis and thus adversely affect cell proliferation potential.

　　线粒体铁蛋白(mitochondrial ferritin, MtF)是2001年才发现的一种铁代谢相关分子，与胞浆铁蛋白具有很高的同源性，也具有亚铁氧化酶活性和铁结合能力，但其表达局限于线粒体[1]。国外初步研究表明，MtF为线粒体内的铁存储蛋白，MtF的表达可使胞浆内铁向线粒体内转运，降低胞浆"可变铁池"(labile iron pool， LIP)水平，细胞呈"缺铁状态"，并通过铁调节蛋白(iron regulatory protein, IRP)和铁效应元件(iron responsive element, IRE)的相互作用在转录后水平上协调调节运铁蛋白受体1(transferrin receptor 1, TfR1)和铁蛋白(ferritin, Fn)表达水平[2]。MtF在细胞铁稳态调节方面可能具有十分重要的作用。

　　中国实验血液学杂志 J Exp Hematol 2007; 15(2)K562细胞诱导分化过程中线粒体铁蛋白表达情况研究线粒体是细胞代谢最为旺盛的细胞器，是血红素和铁硫蛋白合成的主要场所，也是活性氧自由基产生的重要部位[3,4]。白血病细胞增殖代谢旺盛，对铁的需求大，但目前对白血病细胞线粒体铁代谢了解很少。为此，我们采用TPA体外诱导K562白血病细胞定向分化动态研究了K562白血病细胞诱导分化过程中MtF、TfR1和胞浆Fn mRNA表达的变化情况，探讨MtF在白血病细胞线粒体铁代谢调节方面的作用，为建立针对铁代谢途径的白血病治疗新策略奠定理论基础。

　　材料和方法

　　材料和仪器

　　K562细胞株由四川大学华西第二医院实验中心提供。RPMI 1640培养液为美国Gibco公司产品，特级小牛血清为海克隆生物化学制品有限公司产品，TPA为晶美生物工程有限公司产品，TRIZOL试剂为北京天为时代科技有限公司产品，RevertAidTM First Stand cDNA 合成试剂盒为晶美生物工程有限公司产品，PCR MasterMix 试剂盒为北京天为时代科技有限公司产品，流式细胞仪为Coulter EPICS ELITE ESP产品，PCR仪(PTC100型)、凝胶图象分析系统(GDS8000型)为UVP公司产品。

　　RTPCR引物

　　参照有关文献设计[1]，由Invitrogen公司合成。MtF上游引物序列： 5'TATTTCCTTCACCAGTCCCGG3';MtF下游引物序列： 5'GCAGGAGACAGCTGACTTTGG3'，MtF扩增产物长度451 bp。TfR1上游引物序列： 5'AGCACAGACTTCACCAGCACC3'; 下游引物序列： 5'GTCCCCAGATGAGCATGTCC3'， 扩增产物长度506 bp。Fn上游引物序列： 5'CCTCCTACGTTTACCTGTCC3';下游引物序列： 5'GCTTGTCAAAGAGATATTCC3'，扩增产物长度429 bp。内参照βactin上游引物序列： 5'CCAAGGCCAACCGCGAGAG3'，下游引物序列： 5'AGGGTACATGGTGGTGCCGC3'，扩增产物长度587 bp。

　　K562细胞培养

　　K562细胞复苏后加RPMI 1640培养液(含10% FBS、100 U/ml青霉素和100 mg/ml链霉素)在37℃、 5% CO2、饱和湿度孵箱中悬浮培养。

　　实验分组

　　用无血清RPMI 1640培养液将K562细胞悬液调整至浓度为5×105/ml，加入6孔板中，每孔接种量1×106个细胞，置于37℃、 5% CO2、饱和湿度孵箱中进行培养。实验组为TPA诱导分化培养组和对照组，前者根据预实验结果，确定TPA终浓度为16 nmol/ L，对照组为K562细胞普通培养。每孔共设3个复孔。

　　细胞形态观察

　　收集各时点(1、3、5天)的实验组和对照组K562细胞，用PBS洗涤2次，离心涂片后瑞氏染色，凉干后油镜下观察细胞形态，每片计数200个细胞，计算诱导分化率。

　　诱导分化率(%)=(已分化细胞数/200)×100%

　　细胞表面CD64表达的流式细胞术检测

　　收集各时点(1、3、5天)的实验组和对照组K562细胞，于四川大学华西医院肿瘤生物治疗中心检测细胞CD64表达水平。

　　半定量RTPCR

　　细胞总RNA采用TRIZOL试剂盒提取制备，按照产品说明书进行。cDNA第一链合成采用RevertAidTM First Stand cDNA 合成试剂盒。进行逆转录条件为： mRNA模板0.5 μg，Oligo dT 1 μl，加DEPCH2O至总体积为12 μl，70℃恒温5分钟后，冰上冷却;再加入buffer 4 μl， inhibitor 1 μl及dNTP 2 μl，37℃恒温5分钟;最后加MMuLV逆转录酶1 μl(总体积20 μl)，42℃ 1小时，70℃ 10分钟，冷却。PCR扩增采用2×Taq PCR MasterMix 试剂盒。MtF PCR条件为94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸1分钟，30次循环后72℃恒温10分钟。TfR1的PCR条件为：94℃ 2分钟，94℃ 45秒，60℃ 30秒，72℃ 45秒，30次循环后，72℃ 10分钟。Fn的PCR条件为：94℃ 2分钟，94℃ 45秒，56℃ 30秒，72℃ 45秒，30次循环后，72℃ 10分钟。βactin的PCR条件为：94℃ 2分钟，94℃ 45秒，56℃ 30秒，72℃ 1分钟，25次循环后72℃ 10分钟。

　　PCR扩增产物电泳和凝胶成像分析

　　PCR扩增产物于1.5%琼脂糖凝胶电泳后，采用GDS8000凝胶成像分析仪成像分析，计算目标基因与内对照βactin扩增条带像素值之比，判断目标基因mRNA相对表达水平。

　　统计分析

　　对相关资料用SPSS 11.0统计软件分别进行统计学分析。均数比较采用t检验，率的比较采用χ2检验。

　　结 果

　　TPA诱导K562细胞分化的形态学观察

　　瑞氏染色观察可见，对照组K562细胞呈圆形或椭圆形，胞核大而圆，胞浆极少，染色深蓝，94.5%为未分化细胞，早幼阶段以下的细胞仅占5.5%。但TPA处理5天的K562细胞具有典型成熟单核细胞的形态特征，如体积增大，胞浆染色变淡，可见空泡样改变，核浆比例减小，核形态不规则或呈肾形，核仁减少或消失，核染色质趋向致密。诱导分化率为95%，与对照组相比有显著性差异(P<0.05)，表明TPA可诱导K562细胞向单核细胞定向分化(表1，图1)。

　　TPA诱导K562细胞分化过程中CD64表达情况

　　CD64是成熟单核细胞重要的表面标志分子之一。我们采用流式细胞术检测TPA诱导分化过程中，K562细胞表面CD64的表达水平。结果发现，TPA处理后第1天CD64表达与对照组相比已有显著性差异(P<0.05)。随着诱导时间延长，CD64表达明显增强，而对照组K562细胞CD64表达无明显变化(表2)。

　　诱导分化过程中铁代谢相关基因表达变化

　　我们采用半定量RTPCR检测了TPA诱导K562细胞分化第1、3和5天MtF、TfR1和Fn mRNA表达的变化情况。结果显示，K562细胞表达MtF，但随着TPA诱导K562细胞向成熟单核细胞分化，MtF mRNA表达逐渐下调，诱导分化第5天MtF mRNA表达水平为诱导分化前(即实验组0天)的50.3%; 与此同时，FfR1 mRNA表达也逐渐降低，而Fn

　　mRNA表达上调。诱导分化第5天TfR1和Fn mRNA表达水平分别为诱导分化前的68.2%和1.97倍(图2和表3-5)。

　　讨 论

　　铁参与细胞的能量代谢和血红蛋白的生物合成等许多重要的生理过程，为DNA生物合成和细胞生存、增殖所必需。同时铁可通过Fenton反应产生活性氧自由基，损伤生物大分子[5]。大量研究已经表明，细胞内铁稳态主要是通过胞浆内的IRP与铁代谢相关分子mRNA上的IRE的相互作用，在转录后水平上协调调节细胞摄铁分子TfR1和储铁分子Fn的表达，精细调控胞浆LIP水平，这样既可满足细胞各种代谢对铁的需求，又避免过多"游离铁"造成的细胞损伤[6,7]。

　　线粒体是细胞电子转运和氧化还原反应最为活跃和旺盛的细胞器，是血红素和铁硫酸蛋白合成的主要场所。在幼红细胞等细胞中，摄入胞浆中的铁绝大部分进入线粒体，参与血红素合成[3]。线粒体铁池必须与胞浆铁池处于动态平衡之中。但目前对两者间的铁动态交换及其调节机制的认识相当有限。国外初步研究表明，MtF可能在线粒体铁代谢调节方面发挥着重要作用[1，8]。

　　MtF是新近发现的线粒体储铁蛋白，基因定位于5q23.1，为单拷贝无内含子基因，mRNA长度约1 kb，编码区序列与胞浆铁蛋白重链基因同源性高达80%。Levi等[1]研究表明，MtF也具有亚铁氧化酶活性，可将亚铁氧化为高铁，形成无毒性的氢氧化铁，储存在壳状结构的内腔中，防止氧化应激损伤，其摄取外源性亚铁的速率和能力与胞浆Fn相当，而且在去铁胺作用后，MtF结合铁的能力甚至超过胞浆Fn[8]。

　　尽管MtF和胞浆铁蛋白的晶体结构和理化性质极为相似，但前者是由24个亚单位组成的纯多聚体(homopolymer)，而铁蛋白则由重链和轻链组成的24杂多聚体(heteropolymer)。铁蛋白广泛表达于各种组织细胞的胞浆，而生理情况下MtF仅局限性高水平表达于线粒体含量丰富的睾丸组织细胞的线粒体内，而肝、脾等储铁器官和其它组织表达水平很低[9,10]。

　　根据MtF蛋白在线粒体的定位表达，体内外具有与胞浆铁蛋白相当的摄铁能力及与铁结合的可逆性和可被动用性，我们认为，MtF在白血病细胞铁代谢和细胞增殖方面可能发挥着重要作用。因此，我们采用TPA体外诱导K562白血病细胞定向分化，动态了解细胞诱导分化过程中MtF表达水平的变化规律，以及与细胞主要摄铁分子TfR1和胞浆储铁分子Fn表达变化间的相互关系。

　　我们采用TPA作为诱导分化剂，研究了K562细胞在TPA诱导前后的形态学和细胞表型的变化。结果表明，16 nmol/L TPA可诱导K562细胞向单核/巨噬细胞定向分化，不仅呈现出成熟单核/巨噬细胞的形态特征如胞浆染色变淡、核浆比例缩小等，而且代表髓系细胞的CD64表达水平呈上升趋势，这与文献报道的一致[11,12]。

　　尤为重要的是，随着TPA诱导K562细胞分化，MtF mRNA表达水平进行性下调，诱导分化第5天表达水平仅为诱导分化前的50.3%。与此同时，TfR1 mRNA表达也逐渐降低，而Fn mRNA表达上调，诱导分化第5天TfR1和Fn mRNA表达水平分别为诱导分化前的68.2%和1.97倍。我们的研究结果，从相反方面证实了Corsi和Nie两个研究小组的研究结果。Corsi等[8]将MtF转染至HeLa细胞，结果发现HeLa细胞胞浆TfR1蛋白表达显著上调，而胞浆Fn蛋白表达显著下调，提示MtF表达水平增高可导致细胞内铁的"再分布"，使胞浆LIP水平降低，细胞呈"缺铁状态"，利于细胞通过TfR1摄铁;而Nie等[2]通过转染，使H1299细胞株MtF高表达，结果也证实MtF高表达可导致细胞内铁从胞浆向线粒体转移，导致胞浆呈"缺铁状况"，表现为胞浆TfR1表达增高、胞浆Fn表达降低、胞浆IRP与IRE结合力增强、TfR1介导的铁摄取增加。

　　根据以上研究结果，我们认为白血病细胞适度水平的MtF表达，有利于胞浆LIP向线粒体转运，维持线粒体LIP处于一种"适度较高水平"，以满足白血病细胞线粒体中各种代谢对铁的需求;同时降低胞浆LIP水平，使胞浆处于相对"缺铁状态"。细胞通过胞浆中的 "铁感应分子(iron sensor)"(如IRP)感知细胞"缺铁"，从而上调TfR1表达，下调胞浆Fn表达，以利于白血病细胞通过TfR1摄取更多的铁，使白血病细胞具有比正常细胞更强的铁摄取能力。另一方面，白血病细胞同其它恶性肿瘤细胞一样，细胞的增殖周期并非处于同步化状态，因此要求线粒体中也存在某种稳定的"铁储备"。当细胞处于静止期时可以将"游离性亚铁"氧化成高铁状态而储备起来，防止铁参与的氧化损伤，具有保护作用。当细胞进入活跃的增殖期(如G1和S期)时能很快将铁释放出来满足细胞代谢所需。MtF的结构和功能特点使它能够为线粒体内的各种代谢过程提供稳定的铁储备，使白血病细胞具有比正常细胞更强大的铁储备和利用优势。

　　实际上正常幼红细胞中MtF表达水平极低，但铁粒幼细胞贫血环状铁粒幼细胞中MtF表达水平显著增高[13]。推测由于线粒体内血红素合成障碍，铁感应分子感知线粒体缺铁，导致胞浆铁转入线粒体，线粒体铁负荷进行性增加。但为防止线粒体铁蓄积所致的氧化应激损伤，MtF表达"代偿性"上调，将过多的铁以无毒性的形式储存起来，这也提示MtF具有保护作用[14]。

　　最近，Nie等[15]将MtF高表达的H1299细胞株转入裸鼠，造成肿瘤动物模型。结果发现MtF高表达裸鼠肿瘤生长速度和体积显著小于对照组。透射电子显微镜观察发现，MtF高表达的裸鼠肿瘤细胞线粒体中大量铁沉积，肿瘤细胞胞浆IRP结合活性增强，细胞TfR1表达增高，而胞浆Fn表达降低，这说明了细胞处于"缺铁状态"。这一研究结果更直接表明，MtF在细胞铁代谢和肿瘤细胞增殖方面发挥着重要作用。

　　因此， 进一步研究MtF与肿瘤细胞铁代谢和增殖的关系，对于今后采用分子生物学方法靶向调控MtF表达水平，建立针对恶性肿瘤细胞(包括白血病)铁代谢途径的治疗新方法和策略，具有重要意义。

　　【参考文献】

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　　14Napier I, Ponka P, Richardson DR. Iron trafficking in the mitochondria: novel pathways revealed by disease. Blood, 2005; 105:1867-1874

　　15Nie G, Chen G, Sheftell AD, et al. In Vivo tumor growth is inhibited by cytosolic iron deprivation caused by the expression of mitochondrial ferritin. Blood, 2006; 108:2428-2434