携载阿霉素磁性纳米Fe3O4颗粒的制备及逆转多药耐药的实验

　　作者：孙茜,陈宝安,王雪梅1,高峰,戴永援　　作者单位：东南大学附属中大医院血液科，南京 210009

　　【摘要】为了建立一种磁性纳米Fe3O4颗粒携载聚合阿霉素的制备方法，探讨载药纳米颗粒对K562及其耐药株K562/A02的作用，用机械吸附聚合法在4℃、37℃下以不同药球比聚合24、48小时合成载药纳米颗粒，用噻唑蓝比色法检测细胞与载药纳米颗粒悬液孵育48小时后的生存率，并计算细胞抑制率。结果表明： 随着磁性纳米Fe3O4颗粒浓度增加，两种细胞抑制率均提高，聚合在4℃、48小时时的细胞抑制率分别高于37℃、24小时的细胞抑制率。 结论： 磁性纳米Fe3O4颗粒可通过机械吸附法携载阿霉素，聚合具有温度、时间依赖特性;载药纳米颗粒有逆转多药耐药作用。

　　【关键词】 磁性纳米颗粒

　　Abstract To prepare Fe3O4magnetic nanoparticles loaded with adriamycin and investigate the reversal role of drugloaded nanoparticles in K562 and resistant cell line K562/A02, the drugloaded nanoparticles were prepared by using mechanical absorption polymerization at different conditions of 4℃ or 37℃ for 24 or 48 hours. The survival of cells cultured with drugloaded nanoparticles for 48 hours was detected by MTT assay, then the growth inhibition efficacy of cells was calculated. The results showed that the growth inhibition efficacy of both two cell lines was enhanced with increasing concentration of Fe3O4magnetic nanoparticles. The inhibitory ratio of two cell lines obtained at 4℃ and for 48 hours was significantly better than that at 37℃ and 24 hours. In conclusion, Fe3O4magnetic nanoparticles can load adriamycin by using mechanical absorption polymerization, but depended on proper temperature and time. Furthermore, drugloaded nanoparticles showed an ability reversing multidrug resistance.

　　Key words magnetic nanoparticle; Fe3O4magnetic nanoparticle; Adriamycin; mechanical absorption polymerization; multidrug resistance

　　逆转多药耐药(multidrug resistance, MDR)、提高化疗敏感性对于恶性血液病的治疗具有积极意义[1]。纳米材料携载化疗药能够增强化疗敏感性、克服多药耐药。本研究在不同条件下将磁性纳米Fe3O4颗粒(Fe3O4magnetic nanopar ticles，Fe3O4MNPs)采用机械吸附法聚合阿霉素(adriamycin， ADM)[2，3]，考察适宜的聚合条件及载药纳米颗粒对K562及其耐药细胞株K562/A02的作用。

　　材料和方法

　　主要药剂和试剂

　　磁性纳米四氧化三铁(Fe3O4)颗粒由东南大学生物医学工程系生物电子学国家重点实验室提供，使用前将其用新鲜配制的RPMI 1640+10%小牛血清培养液混合，超声混匀，制成分散均匀的Fe3O4MNPs胶体悬浮液;ADM为浙江海正药业公司产品，分散于0.01 mol/L 磷酸盐缓冲液(pH 7.4)，配制成50 mmol/L的母液待用。RPMI 1640为美国Gibco公司产品;小牛血清为杭州四季青生物制品公司产品。

　　人慢性粒细胞白血病、急性红白血病变细胞株K562 (敏感株)由本实验室长期保存。K562的耐药细胞株K562/A02为中国医学科学院血液学研究所提供，K562/A02是对K562细胞株长期的ADM诱导和克隆筛选所建立的一耐药细胞株，维持其增殖的ADM终浓度是1 μg/ml[4]，实验前无药培养2周。K562和 K562/A02细胞均接种于玻璃培养瓶中，加含10%热灭活小牛血清的RPMI 1640培养液置于37℃、5% CO2、饱和湿度培养箱中培养，每2-3天传代1次。

　　Fe3O4MNPs携载ADM的聚合反应

　　不同浓度的Fe3O4MNP (0.05,0.1,0.2,0.4)和一定浓度的ADM(50 μmol/L)聚合的实验分组为： ①Fe3O4MNPADM 0.05组(Fe3 O4MNP 0.05， ADM 50 μmol/L);②Fe3O4MNPADM 0.1组(Fe3O4MNP 0.1， ADM 50 μmol/L);③Fe3O4MNPADM 0.2组(Fe3 O4MNP 0.2，ADM 50 μmol/L);④Fe3O4MNPADM 0.4组(Fe3O4MNP 0.4， ADM 50 μmol/L)。根据分组，在一次性96孔板上用机械吸附聚合法使ADM与分散均匀的Fe3O4MNP胶体悬液混匀充分搅拌后，静置在一定温度(37℃、4℃)和时间(24，48小时)等条件下聚合，调节pH为7.4。另设ADM组(ADM 50 μmol/L)、Fe3O4MNP组(Fe3O4MNP 0.2)同时"接种"于96孔板中作为对照，每组均为3个复孔;此外，空白对照组、阴性对照组在96孔板上作为预留孔。

　　细胞毒性的MTT测定

　　取对数生长期K562和 K562/A02细胞，调整细胞浓度，使得细胞悬液加入上述Fe3O4MNPADM聚合反应的96孔板后的每组的终浓度均为1.5×105/ml，每孔200 μl(空白对照组为仅加200 μl不含细胞的培养液，阴性对照组为仅加200 μl含细胞的培养液)。在37℃、5% CO2、饱和湿度条件下培养48小时后，加入5 mg/ml的MTT 20 μl/well，继续在上述条件下培养4小时后，平板离心机以1 700×g离心5分钟，弃上清。加入二甲亚砜150 μl/well，振荡10分钟，用酶联免疫检测仪540 nm波长条件测定每孔的OD(光密度)值。并按下式计算药物对细胞的抑制率：

　　细胞抑制率(%)=(1-试验孔OD平均值/阴性对照孔OD平均值)×100%

　　统计学处理

　　应用统计软件SPSS 11.5进行统计学分析，每组实验重复3次，以均数±标准差表示。多组均数比较采用单因素方差分析、配对均数比较采用配对t检验、相关系数采用t检验。以p<0.05、p<0.01判断均数统计学有显著性差异。

　　结 果

　　显微镜下携载ADM的Fe3O4MNP的表征

　　在普通光学倒置显微镜下，在非聚合(对照)的情况时肉眼观察到：极少量(2 μl)的阿霉素水溶液为无色(附图A);Fe3O4MNP为黑色颗粒，均匀地分散在悬液中(附图B)。不同浓度的Fe3O4MNPs与相同浓度的阿霉素聚合后呈现红色(附图C、D、E、F)。由附图可以看出D、E组的阿霉素聚合明显多于C、F组。

　　MTT检测结果

　　K562细胞 随着Fe3 O4MNP浓度的增加，聚合条件分别是37℃，24小时和4℃，24小时时，Fe3 O4MNPADM组中K562细胞抑制率均逐渐增强，呈直线相关(r2>0.95, p<0.05);聚合条件在4℃，24小时的细胞抑制率高于37℃、24小时的细胞抑制率(p<0.05)。

　　K562/A02细胞 在以上相同聚合条件下有相似结果，不同的是随着Fe3 O4MNP浓度的增加，细胞抑制率增强均不呈直线相关;聚合条件在37℃，48小时的细胞抑制率高于37℃，24小时的细胞抑制率(p<0.01)。

　　相同条件下K562和K562/A02细胞 K562细胞抑制率显著高于K562/A02细胞抑制率(p<0.01)。

　　讨 论

　　用携载化疗药物的磁性纳米颗粒进行治疗是近年来实体瘤靶向治疗研究的一个新思路[5,6]，而纳米颗粒有天然地被机体单核-吞噬细胞系统阻滞、摄取的特性[7]，故使用这种磁性纳米颗粒也成为血液系统恶性肿瘤治疗的一大尝试。临床上，MDR是化疗失败的主要原因,逆转MDR显得尤为迫切而重要。寻找低毒高效的MDR逆转剂或者化疗增敏剂是目前研发相关药物的主要方向[8]。Fe3 O4MNP来源广泛，制备相对经济简单，体内外及临床实验均提示Fe3 O4MNP对机体无明显毒性[9,10]，Fe3 O4MNP表面是完全无机界面，具有较高的表面活性,粒子本身很容易团聚，这一特点对于聚合包裹药物十分必要。

　　本实验在液相介质中通过机械吸附法使Fe3 O4MNPs携载水溶性药物ADM，以普通光学倒置显微镜表征Fe3 O4MNP携载ADM，过程相对简洁，并能直观反映聚合形貌，而且MTT结果间接显示了与Fe3 O4MNP聚合的ADM的化疗作用强于未聚合的ADM。Fe3 O4MNP携载ADM的聚合反应具有显著 的温度、时间依赖特性，聚合反应的最适条件是4℃，48小时，即低气温、长时间的聚合更有利于载药纳米颗粒作用的发挥。此外，从附图中可以看到C-F组是逐步增加浓度的Fe3 O4MNPs与相同浓度的阿霉素聚合的表征，F组中的Fe3 O4MNP虽然浓度最大，但D、E组阿霉素聚合明显多于C、F组，其原因可能是Fe3 O4MNP携载ADM存在饱和现象，即有最佳药球比，且能以MTT结果间接支持这一推论。Fe3 O4MNPs携载ADM能够明显增加ADM对K562和K562/A02的毒性，起到了逆转多药耐药作用。K562细胞抑制率与Fe3 O4MNP浓度呈直线相关，但K562/A02细胞抑制率与Fe3 O4MNPs浓度并非呈直线相关，最佳药球比(Fe3 O4MNP∶ADM)在 0.1∶50 μmol/L-0.2∶50 μmol/L之间，这可能是K562细胞对化疗敏感，而K562/A02细胞表面存在多种耐药蛋白等诸多复杂MDR因素所致。在多次的细胞毒性测定中Fe3 O4MNP没有明显细胞毒性。由于Fe3 O4MNP具有较高的表面活性,粒子本身很容易团聚，有利于聚合包裹药物，因此Fe3 O4MNP由于自身的独特性能够在细胞内包裹浓聚ADM，能够在不增加药物剂量的前提下达到化疗增敏目的。 Fe3 O4 MNP携载ADM能否增加K562/A02细胞内ADM的有效浓度以及Fe3 O4MNP与多药耐药蛋白的关系尚需实验验证，逆转多药耐药的机制也需进一步明确[11]。

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