造血发育和内皮细胞的关系

　　作者：要晖宇　　作者单位：军事医学科学院基础医学研究所细胞生物学研究室，北京 100850

　　【摘要】研究造血和血管内皮在胚胎发育中的关系，包含对造血细胞和内皮细胞的发育起源以及相关分子调控的探讨。以已有的研究结果为基础，对造血细胞和血管内皮细胞发育关系提出了成血血管细胞(hemangioblast)和生血内皮(hemogenic endothelium)的两种模式。在卵黄囊和PSp/AGM区，造血和内皮细胞的发育关系分别表现出不同的特点：二者在卵黄囊共同来源于成血血管细胞;在AGM区则更多表现为生血内皮的模式。造血和血管内皮相关分子的表达和调控作用的研究，不仅体现了造血和内皮在发育中的密切关系，同时也加深了对造血发育调控的认识。本文就原始造血和永久造血的发育、造血和血管内皮发育相关的两种模式及造血和内皮发育相关分子问题进行了综述。

　　【关键词】 成血血管细胞,生血内皮,造血细胞,内皮细胞,造血发育

　　Abstract Developmental programs of blood and endothelium are closely correlated and remarkably conserved among species. To categorize the ontogeny relationship between hematopoietic and endothelial lineages, two putative models are presented here. In the yolk sac, hematopoietic and endothelial cells are more likely derived from a common precursorthe hemangioblast. By comparison, the hemogenic endothelium is proposed to characterize the generation of hematopoietic stem cells from mature endothelium in the PSp/AGM region. Furthermore, couples of molecules, including Scl, Flk1 and Runx1, are involved in formation and subsequent differentiation of the hemangioblast or hemogenic endothelium during embryonic hematopoiesis. In this article, the development of primitive and definitive hematopoiesis, two models associated with development of hematopoietic and vascular endothelial cells as well as molecules associated with development of hematopoietic and endotheliate cells were summaried.

　　Key words hemangioblast; hemogenic endothelium; hematopoietic cell; endothelial cell; hematopoietic development

　　造血发育学是正确认识造血干细胞的细胞起源及分子调控的研究基础，对有效获得并扩增造血干细胞达到临床应用目的有着重要的意义。最早在鸟类胚胎研究中观察到造血细胞和血管内皮细胞的发育在时间和空间上密切相关;随后的研究表明，二者在发育上的密切关系在不同的种属，包括鱼类、两栖类、小鼠和人之间非常相似。因此，二者的发育学关系成为众多研究者关注的问题，随着研究的不断进展，人们对造血和内皮细胞确切的起源以及相关分子调控机理有了进一步的认识。

　　原始造血和永久造血的发育

　　在小鼠胚胎发育过程中，卵黄囊血岛是造血细胞最早发生的位点。胚胎发育7.5天，由胚外中胚层来源的细胞产生的内皮和造血细胞共同组成血岛，此时的造血细胞主要是原始红系，其特点为圆核、胞体较大并表达胚胎型血红蛋白(ε, ζ和βH1型)。卵黄囊来源的血细胞形态和表型上的特点更接近于低等脊椎动物体内的血细胞，因此将胚胎早期卵黄囊中的造血发生称为原始造血(primitive haemato poiesis)。体外实验表明卵黄囊也可产生永久造血干/祖细胞，但由于微环境和其他可能的原因，卵黄囊来源的造血干/祖细胞自我更新能力弱，分化能力强，数量迅速减少。因此，卵黄囊造血表现为胚胎发育过程中第一波的一过性造血，并不是随后发生的胎肝和骨髓造血的主要来源。

　　永久造血(definitive haematopoiesis)是指胚内PSp/AGM(paraaortic splanchnopleura/aortagonad mesonephros)来源的造血干细胞产生的胎肝及骨髓造血。小鼠胚胎背主动脉及其周围中胚层来源组织，在胚胎10天之前称为主动脉旁脏壁层(PSp)，之后此位置发育成为主动脉性腺中肾(AGM)区。研究者在PSp/AGM区发现了具有包括淋系分化能力的多能造血祖细胞和CFUS。进一步的研究证明，在卵黄囊与胚内血循环建立之前具有淋系分化潜能的造血细胞只存在于PSp/AGM区，其造血发生是独立而自发的。AGM区产生造血干细胞是在胚胎第10.5天，虽然胚胎11.5天的卵黄囊也可发现造血干细胞，但此时血循环已建立，因此不能排除卵黄囊造血干细胞来源于AGM区。与卵黄囊不同的是，造血干细胞不能在AGM区分化扩增，而是种植于胎肝和其后的骨髓，从而产生胎肝和骨髓造血，是成体造血的起源。

　　最初的卵黄囊血岛是产生于胚外中胚层的细胞团，随着胚胎的发育外围细胞分化为血管内皮细胞，而中央细胞分化为原始红系细胞。内皮细胞和造血细胞在时间和空间上的同步协调发育是血岛形成的关键。这种发育上的密切相关很容易使研究者直观地认为，造血细胞和内皮细胞来源于一个共同的祖细胞，称为成血血管细胞(hemangioblast)。造血细胞和内皮细胞共同表达一些细胞表面受体及转录因子，如Flk1, Tie2, Scl, Epo受体和CD34等，并且Flk1基因的敲除导致小鼠造血和内皮发育同时缺失，这些结果使研究者更加确信造血细胞和内皮细胞的共同起源，但证明成血血管细胞存在的较为有力的证据是小鼠胚胎干细胞来源的BLCFC (blastcolony forming cell)。Choi等[1]在有SCF和VEGF存在的胚胎干细胞分化体系中找到一种特殊形态的集落;进一步诱导分化发现，集落来源于非贴壁细胞且具有造血分化的能力，并可产生高增殖潜能集落形成细胞(HPPCFC)[2]，而贴壁细胞表现为内皮细胞的特点。可以认为形成这种集落的BLCFC在体外代表了成血血管细胞。随后证明在小鼠胚胎早期(E7E7.5)也存在BLCFC，同样具有造血和内皮的双向分化能力[3]，胚胎干细胞和胚胎来源的BLCFC在产生时间上相互吻合，并且都具有一过性的特点，即在造血细胞和内皮细胞产生之后BLCFC随之消失。胚胎干细胞来源的BLCFC可产生原始红系和永久红系细胞[4]，而原始红系细胞的产生是卵黄囊造血的特点，同时，胚胎来源BLCFC在原条产生后逐渐向卵黄囊发育的位置迁移，因此，BLCFC所代表的成血血管细胞很有可能是卵黄囊造血细胞和内皮细胞的共同前体。

　　AGM区主要由背主动脉内皮及周围间质、性腺和中肾组成，而造血干/祖细胞主要产生于主动脉及周围间质。背主动脉腹侧壁出现的造血细胞簇是AGM区可观察到的最早的造血细胞，其根部的细胞以类似出芽的方式产生于主动脉内皮细胞壁，这些造血细胞和主动脉内皮细胞共表达一些内皮细胞表面标志如CD31、Flk1和VECadherin等。在造血细胞簇出现之前，用DiIAcLDL标记鸡胚主动脉内皮细胞，随后出现的CD45+的造血细胞簇同样带有DiI标记。类似的实验在小鼠胚胎中也证明，AGM区产生的永久红系祖细胞同样来源于DiIAcLDL标记的主动脉内皮细胞[5]。由此可见，AGM区的造血细胞可能产生于内皮细胞，这种可产生造血细胞的内皮细胞称为生血内皮(hemogenic endothelium)，是区别于成血血管细胞的另外一种解释造血细胞和内皮细胞发育关系的模式。

　　VECadherin被认为是内皮细胞表达较早的特异性表面标志，因此在寻找生血内皮的实验中VECadherin+细胞受到广泛关注。Nishikawa等[6]证明，AGM区VECadherin+CD45-Ter119-内皮细胞在体外可获得包括淋巴细胞在内的造血细胞。11.5天Runx1+/-小鼠胚胎AGM区可重建成体造血的造血干细胞包含在两个细胞群体内：VECadherin+/CD31+CD45+的主动脉内细胞簇和VECadherin+/CD31+CD45-的内皮细胞[7]。体内实验也同样表明造血干细胞产生于内皮细胞，在Sca1基因的调控序列下游转入GFP的转基因小鼠AGM区主动脉壁内皮细胞中可见GFP+细胞;同时，主动脉腹侧壁的造血细胞簇内也可观察到GFP+细胞并且与内皮细胞相连[8]。Sca1是有效富集造血干/祖细胞的表面标志，因此内皮细胞中的GFP+细胞提示内皮细胞可产生造血干细胞。随后的成体造血重建实验证明，第11.5天胚胎AGM区的所有的造血干细胞包含在GFP+细胞群内[7]。以上实验结果支持生血内皮的存在，尤其在AGM区造血和内皮的发育关系更多地显示生血内皮的模式。

　　虽然造血干细胞在AGM区仍然没有得到明确定位，但造血细胞簇的发生却只局限在主动脉的腹侧壁，这与主动脉及周围间质发育当中其腹侧所表现出的特殊性有关。鸡胚主动脉腹侧壁的内皮细胞来源于脏层中胚层，而其他部位内皮细胞来源于体节。腹侧壁内皮细胞在产生造血细胞簇的同时也可向主动脉腹侧间质中迁移，形成特殊的结构para aorta foci[9]。在小鼠主动脉腹侧间质中同样存在一个特殊区域类似于鸡胚的para aorta foci，称为SAP (sub aorta patches)，在这里可检测到造血相关的GATA3和AA4.1的空间特异性表达[10，11]。除此之外，下列证据表明SAP的出现与AGM区造血干细胞的产生有直接关系[12]：① SAP存在的时间与AGM区造血发生的时间相一致;②其位置严格而准确地定位在主动脉造血细胞簇产生的位置的腹侧下方;③胚胎12.5 dpc SAP消失，随后AGM区已检测不到造血干细胞的产生。最新的研究发现，10.5 dpc CD45-/low ckit+AA4.1+ Flk1-/low SAP细胞为多能造血祖细胞，同时可重建Rag2γc-/-免疫缺陷型小鼠的造血[13]，这进一步提示SAP含有造血干细胞。然而很少有证据表明SAP产生的造血与内皮细胞有何种关系，主动脉腹侧的生血内皮细胞与SAP的关系也不得而知。但背主动脉存在mesoangioblast的发现[14]却提示在主动脉及其周围间质(包括SAP)中有存在成血血管细胞的可能。Mesoangioblast具有干细胞的自我更新和多向分化的特点，然而值得注意的是它的多向分化能力，包括向造血细胞、内皮细胞和平滑肌细胞的分化，这些细胞也可以由BLCFC分化产生[3]。显然，在发育过程中mesoangioblast处在成血血管细胞的上游，随着mesoangioblast的分化和可能的迁移，在SAP寻找成血血管细胞是值得期待的。

　　胚胎干细胞体外诱导分化及BLCFC模型结合基因敲除的方法，有利于揭示中胚层细胞定向造血和内皮分化的分子机制。相关的研究已发现，Flk1和Scl在成血血管细胞、造血细胞和内皮细胞中表达谱的变化很好地描绘了造血细胞和内皮细胞发育的过程。Flk1是VEGF的受体，在小鼠胚胎原条期的中胚层就可检测到Flk1的表达，随后的表达显示了内皮细胞的特异性，但Flk1-/-小鼠表现出造血和内皮的发育缺陷，这说明了其在造血发育中同样重要。Scl/Tal1是一种bHLH型转录因子，在小鼠胚胎中的表达比Flk1稍晚，其调控作用在造血发育中至关重要，虽然内皮细胞的产生并不依赖Scl/Tal1，但可影响血管的形成。Fehling等[15]研究发现，胚胎干细胞来源的Brachyury+中胚层细胞获得Flk1表达的细胞亚群包含了BLCFC，体内实验同样证明75%的BLCFC为Brachyury+Flk1+。不同的研究者对BLCFC是否表达Scl存在不同看法，但可以肯定的是，Scl是BLCFC具有造血和内皮的双向分化能力是所必需的，因为Scl-/-胚胎干细胞可以产生BLCFC，但不能产生典型形态的blast集落，同时也失去了造血和内皮的双向分化能力[16]，因此Flk1+Scl+代表真正的成血血管细胞是可以理解的。在Flk1+Scl+细胞中Flk1下调显示了成血血管细胞定向造血分化的趋势。向Flk1-/-胚胎干细胞中外源性导入Scl可使Flk1-/scl胚胎干细胞直接分化产生Flk1-Scl+造血细胞，而不经过Flk1+Scl+成血血管细胞，这也显示了Scl在造血发育中的关键作用[17]。另一方面，Flk1是内皮细胞发育所必需的，内皮细胞可来源于Flk1+Scl+和Flk1+Scl-两群细胞[18]，这提示了内皮的成血血管细胞和成血管细胞两个来源。因此，在成血血管细胞定向造血细胞和内皮细胞分化过程中，Flk1和Scl在两个方向上起着平衡的调节作用。

　　Runx1/AML1与人急性髓系白血病(acute myeloid leukemia, AML)有关，同时也是重要的造血发育调控转录因子。Runx1可通过一个高度保守的runt结构域与DNA结合，因此也称为CBFα2(core binding factorα2)。Runx1-/-小鼠胚胎永久造血发育缺失，但原始红系细胞的产生不受影响。胚胎干细胞体外实验结果表明，永久造血发育对Runx1的依赖发生在BLCFC水平，Runx1-/-胚胎干细胞来源的BLCFC数量显著下降，但可产生正常水平的原始红细胞，而永久造血细胞的产生却因此受到阻断[19]。在产生永久造血的PSp/AGM区，Runx1+造血细胞簇出现发生在主动脉腹侧内皮细胞表达Runx1之后，而在Runx1基因缺失的小鼠胚胎PSp/AGM区则观察不到造血细胞簇的产生[20]。这些结果表明，无论成血血管细胞还是生血内皮细胞，在其定向造血发育中Runx1的调控是必需的。最近的研究发现，Runx1+/-小鼠胚胎AGM区Runx1+内皮细胞和Runx1+间质细胞具有造血干细胞活性[7]，表明在Runx1单倍体缺失而造血发育异常情况下，Runx1的表达激发了本已具有造血潜能的内皮细胞和间质细胞的造血活性，从而达到代偿作用。

　　结 语

　　小鼠成体造血有严格的发育层次：由造血干细胞到多能祖细胞再到终末分化的各系造血细胞，而胚胎造血发育则表现为相反的趋势，在造血干细胞产生的胚胎发育中期10.5天之前，卵黄囊和AGM区已含有多能造血祖细胞和(或)分化的造血细胞。成血血管细胞和生血内皮细胞在一定程度上可解释早期胚胎造血的细胞起源，但胚胎造血干细胞是否来源于成血血管细胞和(或)生血内皮细胞，尤其是永久造血干细胞的细胞起源与内皮的关系，尚需要进一步研究。

　　【参考文献】

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