真性红细胞增多症的细胞遗传学研究

　　作者：段丽敏　　作者单位：南京医科大学第一附属医院血液科，南京 210029

　　【摘要】为了研究真性红细胞增多症(polycythemia vera, PV)的细胞遗传学特点，并探讨间期荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization, FISH)技术在检测PV中8三体和9三体的价值，采用常规细胞遗传学(conventional cytogenetics, CC)技术检测50例初诊PV患者，用间期FISH技术检测PV患者中的8三体和9三体，并以8名正常人骨髓细胞作为对照。 结果表明：50例PV患者中CC检出3例核型异常，1例为8三体，1例为Y染色体缺失，1例为11号染色体倒位。FISH检测2例为8三体，1例与CC检测结果一致。CC未检出9三体， FISH检出1例9三体。 结论：PV患者中染色体异常发生率偏低，其中8三体和9三体发生率略低于国外报道，可能与样本的选择及数量的大小有关;间期FISH技术对检测三体有重要价值，是CC的重要补充。

　　【关键词】 真性红细胞增多症,荧光原位杂交,细胞遗传学

　　Abstract In order to evaluate the incidence of chromosomal abnormalities in patients with polycythemia vera(PV) accurately and to investigate the value of fluorescence in situ hybridization (FISH) technique in the detection of trisomies 8 and 9, conventional cytogenetics (CC) technique was used to detect karyotype and interphase FISH was used to detect trisomies 8 and 9 in 50 newly diagnosed PV and 8 normal individuals. The results showed that out of 50 cases, the 3 cases had chromosome karyotype abnormality, including trisomy 8, deletion of chromosome Y and inversion of chromosome 11 by CC technique. FISH method detected two cases of trisomy 8, including one case confirmed by CC technique, and one case of trisomy 9 neglected by CC technique. It is concluded that the incidence of chromosomal abnormalities in patients with PV is rare, and the incidence of trisomy 8 and trisomy 9 found in this study are relatively lower than that have been reported which may be related to the limited number of samples. Interphase FISH, as an important complement to CC, is a useful method for the detection of trisomies 8 and 9.

　　Key words polycythemia vera ; fluorescence in situ hybridization ; cytogenetics

　　真性红细胞增多症(polycythemia vera，PV)是一种慢性克隆性骨髓增生性疾病。国外报道，PV患者中染色体异常发生率约15%-25%，5、8、9和20号染色体异常多见，其中8号染色体三体(8三体)和9号染色体三体(9三体)是该疾病最常见的染色体数目异常。染色体核型可能对于PV诊断、预后判断和检测克隆消长等具有重要意义[1，2]。我们采用常规细胞遗传学(conventional cytogenetics，CC)技术检测50例PV患者的染色体核型，同时用间期荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization，FISH)技术检测50例PV患者中的8三体及9三体，以研究PV的细胞遗传学特点，并探讨间期FISH在检测PV染色体数目异常中的价值。

　　材料和方法

　　病例及对照

　　50例PV患者均为2001年1月至2006年6月在南京医科大学第一附属医院及苏州大学附属第一医院进行染色体核型分析的初诊 PV 患者 。 PV 按文献[3]标准确诊。50例PV中，男28例，女22例，年龄25-76岁(中位年龄52.5岁)。正常对照选用8份血液系统正常的骨髓标本。

　　探针标记

　　中国实验血液学杂志 J Exp Hematol 2007; 15(1)真性红细胞增多症的细胞遗传学研究8号染色体着丝粒探针，由法国南特大学医学院医院中心血液实验室的Avet Loiseau教授惠赠，SpectrumGreen及Nick Translation试剂盒购自美国Vysis公司,采用缺口平移法标记。荧光素SpectrumAqua直接标记的9号染色体着丝粒探针购自Vysis公司。标记探针-20℃保存备用。

　　CC分析

　　应用肝素抗凝取患者骨髓, 经短期(24小时)培养法37℃培养后, 常规收获, 核型分析采用R带显带技术。核型异常描述按《人类细胞遗传学国际命名体制(ISSN)》(2005年版)，至少2个细胞有3条8号染色体或3条9号染色体定义为8三体或9三体。

　　FISH分析

　　采用直接间期FISH检测。取出储存于-20℃的染色体标本，换用新鲜的3∶1甲醇/冰醋酸，滴片，于37℃ 2×SSC中30分钟，以70%、85%和100%的乙醇室温梯度脱水，每梯度2分钟，在变性液(70%的甲酰胺/2×SSC)中72℃变性3分钟，以70%、85%和100%的冰乙醇(-20℃)梯度脱水，晾干;将1 μl SpectrumGreen标记的8号染色体着丝粒探针(或SpectrumAqua标记的9号染色体着丝粒探针)与杂交液9 μl混合，在72℃水浴中变性5分钟，然后加于染色体标本上，盖上盖玻片，用胶封片后放入预热的湿盒中，37℃杂交16-18小时;杂交后标本在72℃ 0.4×SSC/0.1% Tween20中洗涤2分钟，继之在0.4×SSC/0.3% Tween20中室温洗涤1分钟 ,避光晾干后加含DAPI的抗褪色液复染标本。

　　荧光显微镜检查

　　用Leica DMRA2荧光显微镜在FITC单色滤色镜的激发下观察间期细胞的荧光杂交信号，绿色信号即为8号染色体，蓝色信号即为9号染色体。每例分析500个间期细胞，不计数重叠细胞。

　　统计学处理

　　用统计软件SPSS 10.0对实验结果进行统计处理，采用Fisher确切概率检验。

　　结 果

　　正常对照组

　　染色体核型分析显示，8名对照者均为正常核型。FISH检测8三体时，结果出现3个绿色荧光信号的间期细胞，发生率为0.2%-2.2%，其均数为1.45%，标准差为0.75%。依据文献报道的正常界限确定方法(±2SD)设定本研究正常值为小于2.95%，故将>2.95%的3个绿色信号者确定为8三体;FISH检测9三体时，结果出现3个蓝色荧光信号的间期细胞的发生率为0.5%-2.8%，其均数为1.38%，标准差为0.75%，设定本研究正常值为小于2.88%，故将>2.88%的3个蓝色信号者确定为9三体。

　　CC检测染色体核型

　　50例PV患者中，46例为正常核型，1例未见分裂相，3例具有克隆性染色体异常。在此3例中1例为8三体，1例为Y染色体缺失，1例为11号染色体倒位。染色体异常发生率为6%。

　　FISH检测8三体及9三体

　　50例PV患者中，48例3个绿色荧光信号细胞<2.95%，2例3个绿色荧光信号细胞>2.95%(9.4%、48.8%)，PV患者中8三体的发生率为4%。50例PV患者中，49例3个蓝色荧光信号细胞<2.88%，1例3个蓝色荧光信号细胞>2.88%(5%)，PV中9三体的发生率为2%。

　　FISH与核型的关系

　　由于受细胞分裂周期的影响，以及所分析的中期细胞数量的限制，难以估计中期染色体分析是否能全面地反映患者体内的克隆的大小。表1显示1例CC检测为8三体的患者中，FISH检测结果与其一致，但检出率低于CC的检出率，二者检测的差异为12.7%。CC检测未发现8三体的49例患者中，FISH检测发现1例>2.95%的3个绿色信号间期细胞，即为8三体，阳性率为9.4%。CC检测PV中8三体的发生率为2%，FISH检测PV中8三体的发生率为4%，两者有显著性差异(P<0.05)。50例PV患者中，CC未检测到9三体，FISH检测发现1例>3%的3个蓝色信号间期细胞，即为9三体，阳性率为5%。FISH检测9三体发生率为2%。

　　讨 论

　　真性红细胞增多症(PV)是一种骨髓增生性疾病，由于造血干细胞的克隆性增殖导致红细胞过度生成，从而引起一系列临床表现,其临床特点是发病缓慢，病程较长，红细胞明显增多，常伴有白细胞及血小板数增多，血栓发生率明显高于正常人，PV可进展为骨髓纤维化或急性白血病。自1975年PV研究小组(PVSG)制定了PV的诊断标准以来，迄今PV仍为排除性诊断，主要需除外继发性红细胞增多症。由于PV为一种克隆性疾病，Pearson等[4]提议可将一些实验室检查如克隆性标志作为诊断的主要标准。内源性红细胞集落生成被认为是PV的一种标记，但该试验检查繁琐，且没有统一标准，因此并没有被推广应用于PV的诊断[5];X连锁基因多态性及灭活式样分析也可对PV患者的血细胞进行克隆性检测，然而最近研究证实此方法仍需谨慎应用，因为在一些老年女性中也可看到难以和PV患者区别的X染色体失活[6]。因此，染色体核型异常作为克隆细胞的直接标志，在PV诊断中可能具有潜在的应用价值。

　　多项研究表明，在PV初诊时染色体核型异常的发生率为15%-25%，常见的异常有del(20)、+8、+9，另外还有dup(1q)、del(13q)、del(5q)等。8三体在异常核型中的比率为20%，常单独出现，有时伴有9三体。9三体在异常核型中的比率为16%-20%。有报道认为，9三体预示着PV急变机率的增加，尤其当9三体和dup(1q)同时存在时[7]。Paulsson等[8]报道，PV中8三体的发生率为7.5%。Westwood等[9]报道,8三体的发生率为4.7%(64例中3例)，9三体发生率为3.1%(64例中2例)。随着并发症的出现及疾病的进展，异常核型的发生率增加，并且有新的异常核型出现，在髓样化生期可有70%-90%的异常核型出现，而在转化为急性白血病时异常核型的发生率可达到90%-100%[10]。

　　本研究中，CC检测到初诊PV染色体核型异常的发生率为6%，证实PV的染色体异常发生率偏低。FISH检测8三体和9三体的发生率分别是4%和2%，均低于国外报道，我们考虑可能与标本数量有关，为此可以扩大样本数量做进一步研究。

　　FISH技术不受细胞分裂及中期分裂相数目、质量的影响，具有操作简单、敏感度高、特异性强的特点，是一种非常有用的技术[11]。我们用8号和9号染色体着丝粒特异性探针和间期FISH对50例PV患者进行了系统研究，并与传统细胞遗传学检测结果相比较。结果显示，CC检测到了1例8三体，经FISH得到了证实，但FISH检出率低于CC检出率。中期分裂相和间期细胞异常克隆检出率差异的原因不甚清楚。Fugazza等[12]认为，8三体细胞在体外具有增殖优势，8三体细胞的细胞周期时间较正常二倍体细胞短。我们用FISH检测出1例CC未检测到的8三体和1例9三体，表明FISH检出非整倍体的敏感性高于CC。

　　总之，PV初诊时染色体异常发生率较低，但随着疾病的进展，染色体异常发生率增加。染色体异常与疾病的持续时间及预后是否相关尚未得到证实，但这种改变的非随机模式可能提示了这些染色体上的某种基因影响了疾病的发生或进展。FISH因其简单、敏感、特异性的特点可以进行定期和长期的细胞遗传学评估，大样本的研究和长期的FISH技术随访可能会有助于评价PV中这些染色体异常的价值。

　　【参考文献】

　　1Amiel A, Gaber E, Manor Y, et al. Fluorescence in situ hybridization for the detection of trisomies 8 and 9 in polycythemia vera. Cancer Genet Cytogenet, 1995; 79: 153-156

　　2Zamora L, Espinet B, Florensa L, et al. Is fluorescence in situ hybridization a useful method in diagnosis of polycythemia vera patients? Cancer Genet Cytogenet, 2004; 151: 139-145

　　3张之南，沈悌主编. 血液病诊断及疗效标准. 第2版，北京：科学出版社, 1998: 141-148

　　4Pearson TC. Evaluation of diagnostic criteria in polycythemia vera. Semin Hematol, 2001; 38(Suppl 2): 21-24

　　5Briere J, elKassar N. Clonality markers in polycythaemia and primary thrombocythaemia. Baillieres Clin Haematol, 1998; 11: 787-801

　　6Gilbert HL, Acharya J, Pearson TC. Implications for the use of Xchromosome inactivation patterns and their relevance to the myeloproliferative disorders. Eur J Haematol, 1998; 61: 282-283

　　7Andrieux JL, Demory JL. Karyotype and molecular cytogenetic studies in polycythemia vera. Curr Hematol Rep, 2005; 4: 224-229

　　8Paulsson K, Sall T, Fioretos T, et al. The incidence of trisomy 8 as a sole chromosomal aberration in myeloid malignancies varies in relation to gender, age, prior iatrogenic genotoxic exposure, and morphology. Cancer Genet Cytogenet, 2001; 130: 160-165

　　9Westwood NB, GruszkaWestwood AM, Pearson CE, et al. The incidences of trisomy 8, trisomy 9 and D20S108 deletion in polycythaemia vera: an analysis of blood granulocytes using interphase fluorescence in situ hybridization. Br J Haematol, 2000; 110: 839-846

　　10Andrieux J, Demory JL, Caulier MT, et al. Karyotypic abnormalities in myelofibrosis following polycythemia vera. Cancer Genet Cytogenet, 2003; 140: 118-123

　　11张世彪，刘世和，李娟等. 荧光原位杂交和常规核型分析检测骨髓增生异常综合征8号染色体三体的比较. 中国实验血液学杂志，2002; 10: 115-118

　　12Fugazza G, Bruzzone R, Dejana AM, et al. Trisomy 8 detection in Ph+ CML patients using conventional cytogenetic and interphase fluorescence in situ hybridization techniques. Cancer Genet Cytogenet, 1994; 72: 42-27