静脉血栓栓塞症患者活化蛋白C抗性及凝血因子Ⅴ活性和基因多态性研究

　　作者：韩轩茂,任景芳,郝斌,曹文东,刘秀娥　　作者单位：山西医科大学第二医院血液科， 1血管外科，太原 030001;　2上海交通大学瑞金医院输血科，上海 200050

　　【摘要】本研究旨在观察静脉血栓栓塞患者凝血因子Ⅴ(FactorⅤ, FⅤ)活性改变，检测活化蛋白C抗性(activated protein C resistance, APCR)和凝血因子Ⅴ基因FⅤLeiden、 FⅤCambridge、FⅤHong Kong、 FⅤAsp79His和FⅤI359T多态性。对95例静脉血栓栓塞患者(其中下肢深静脉血栓79例，肺栓塞4例，下肢深静脉血栓合并肺栓塞12例)和95例正常对照者。应用限制性内切酶片段长度多态性测定FV Leiden、FⅤCambridge和FⅤHong Kong多态性， 用MassARRAYTM技术检测FⅤAsp79His、FⅤI359T多态性。以一期法和校正的APTT试验分别对其中的65例静脉血栓栓塞患者和60例正常对照者行凝血因子Ⅴ活性水平和活化蛋白C抵抗检测。结果表明：静脉血栓栓塞患者血浆凝血因子Ⅴ活性水平(108.03%±28.29%)高于对照组(95.17%±29.75%)，差异有显著性统计学意义(P=0.008);静脉血栓栓塞组活化蛋白C抵抗阳性13例(20.0%)，对照组3例(5.0%)，二组比较，有统计学意义(P=0.012)。二组均未发现FV Leiden、FⅤCambridge、FⅤHong Kong、 FVAsp79His和FV I359T多态性。结论：凝血因子Ⅴ活性升高和活化蛋白C抵抗是静脉血栓栓塞的危险因素，但APCR与FⅤLeiden、FⅤCambridge、FⅤHong Kong、 FⅤAsp79His和FⅤI359T多态性无关。

　　【关键词】 静脉血栓栓塞,活化蛋白C抵抗,凝血因子Ⅴ 基因多态性

　　Abstract The study was aimed to investigate the factor V coagulation activity (FⅤ:C), and to evaluate FⅤgene polymorphisms and activated protein C resistance (APCR) in the patients with venous thromboembolism (VTE). 95 patients with VTE and 95 normal controls were investigated for FⅤ gene polymorphisms. FV Leiden, FⅤCambridge, and FⅤHong Kong were detected by PCR, MnlI and BstNI digestion respectively. FⅤAsp79His and FⅤI359T were detected by MassARRAYTM. FⅤ:C and APCR in 65 patients with VTE and 60 normal controls were determined by a onestage clotting method and the APTTbased assays respectively. The results showed that the mean levels of plasma FⅤ:C were significantly higher in VTE group than that in controls (108.03%±28.29% vs 95.17%±29.75%) (P=0.008), the incidence of APCR were 20.0% (13 of 65 cases) in patients with VTE and 5.0% (3 of 60 cases) in normal controls (P=0.012). FV Leiden, FⅤCambridge, FⅤHong Kong, FⅤAsp79His and FⅤI359T mutations were not found in two groups. It is concluded that the increased plasma level of FⅤ:C is a risk factor for VTE. There is APCR in both groups, APCR is also a risk factor to VTE. APCR may not be associated with mutations of FV Leiden, FⅤCambridge, FⅤHong Kong, FVAsp79His and FV I359T polymorphisms, other factors need to study further in APCR.

　　Key words venous thromboembolism; activated protein C resistance; factor V coagulation activity; gene polymorphisms

　　静脉血栓栓塞症(venous thromboembolism， VTE)包括深静脉血栓形成 (deep venous thrombosis， DVT)和肺血栓栓塞症(pulmonary thromboembolism， PTE)，是一组严重危害人类健康和生命的疾病。在西方国家的人群中，VTE是仅次于冠心病和高血压的重要疾病。年发病率约为1‰-5‰，且复发率高(2年1‰，8年30.3‰)。在美国，每年发生VTE的病例约为200万，其中1/3为PTE，2/3为单独的DVT [1]。在我国尚缺乏大规模流行病学调查资料,但VTE也是一种常见病和多发病，且发病率呈上升趋势。

　　静脉血栓栓塞症患者活化蛋白C抵抗和凝血因子Ⅴ基因多态性的检测本研究旨在观察静脉血栓栓塞患者凝血因子Ⅴ活性水平，了解活化蛋白C抵抗和凝血因子Ⅴ基因FVLeiden、 FVCambridge、FVHong Kong、 FVAsp79His和FVI359T多态性在静脉血栓栓塞患者中的发生率。

　　材料和方法

　　研究对象

　　VTE组：选自山西医科大学第二临床医学院和上海血液病研究所2004年3月至2005年9月住院及门诊VTE患者，共95例，男56例，女39例，年龄16- 82岁，平均50.8±14.3岁;其中深静脉栓塞(DVT)79例，肺栓塞(PE)4例，DVT合并 PE 12例。诊断标准参照中华医学会呼吸病分会制订的肺血栓栓塞症的诊断与治疗指南(草案)。DVT通过病史、多普勒超声或静脉造影确诊，PE由血管造影或通气灌注肺扫描证实。其中DVT患者均发生于下肢，包括腘静脉、股静脉、或髂股静脉。排除疾病：恶性肿瘤、骨髓增生性疾病、系统性红斑狼疮、全身感染、创伤、长期制动、口服避孕药和肝、肾功能异常。

　　对照组：选自山西医科大学第二临床医学院体检中心健康者共95例，其中男54例，女41例，年龄23-71岁，平均52.0±13.8岁。经常规检查未发现异常者，无VTE史、无动脉疾病(脑卒中、心肌梗死和周围动脉疾病)、无反复妊娠丢失及肿瘤病史。

　　标本采集

　　研究组与对照组均采用3.8%枸橼酸钠抗凝管，空腹抽取肘静脉血4 ml， 2000×g离心15分钟，分离血浆和血细胞，-80℃分别冻存，待测。

　　FⅤ∶C检测

　　FⅤ∶C试剂盒购自德国Dade Behring公司，一期法行FⅤ∶C水平测定。

　　APCR检测

　　采用BIOCLOT FⅤaaPC Resistance试剂盒，SYSMEX CA7000型血液凝固仪。用校正的APTT法行APCR测定，APC比值≤2.0提示APCR。

　　FⅤ基因多态性检测

　　基因组DNA的抽提 按常规酚氯仿异戊醇抽提法抽提基因组DNA。标化DNA浓度为5-15 ng/μl。

　　多聚酶链反应限制性内切酶长度多态性(polymerase chain reaction restriction fragment length polymorphism, PCRRLFP)分析 PCRRLFP分析FⅤLeiden和R306(FⅤCambridge或FⅤHong Kong) 用以扩增包含1691G/A和R306片段引物序列，详见表1。

　　PCR条件 1691G/A和R306片段的PCR条件相同，取各样本基因组DNA 0.5 μg, PCR反应总体积为25 μl, 引物终浓度为1 μmol/L，缓冲液及dNTP浓度按照常规。在热循环仪上(PTC200 MJ RESARCH公司)95℃预变性5分钟;95℃变性30秒，60℃ 30秒，72℃延伸30秒，共30个循环;延伸，10分钟。PCR 产物在2% 琼脂糖凝胶电泳鉴定。

　　1691G/A片段的酶切 取PCR 产物10 μl, Mnl I 酶(Biolabs) 4 U , 于37℃酶切3小时，溴化乙锭染色, 紫外灯下观察。

　　R306片段的酶切 取PCR 产物10 μl, BstNI 酶(Biolabs) 1 μl及酶切缓冲液2 μl, 于37℃酶切16小时。酶切产物于2% 琼脂糖凝胶电泳, 溴化乙锭染色, 在紫外灯下观察，拍照。

　　基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱分析(matrixassisted laser desertion/ioni timeof flight mass spectrometry, MALDITOF) MALDITOF检测FVAsp79His、FV I359T多态性引物由上海申兰生物技术有限公司合成。

　　引物 FV AsP79His P1: ACGTTGGATGTTGAGGATGGATGCTCAAGG; P2: ACGTTGGATGTGGGCCTACTTTATATGCTG。 FV I359T P1: ACGTTGGATGGGACTCATCTTCGTACTGTG; P2: ACGTTGGATGATACAGGTCTCAGCATTTGG。

　　PCR多重扩增 ①反应体系：总体积20 μl，其中10×Buffer 0.625 μl，引物(10PM) 0.05 μl×2，dNTPmix (10 mmol/L) 0.254 μl, MgCl2(25 mmol/L)0.325 μl, Hotstar Taq酶 0.03 μl，DNA模板(5-10 ng) 1 μl。② 反应程序：95℃ 15分钟, 95℃ 20秒, 56℃ 30秒, 72℃ 1分钟, 45个循环，72℃ 3分钟;4℃ ∞。

　　PCR产物纯化 ① 反应体系：总体积7 μl，其中PCR产物5 μl，SAP混合液2 μl (SAP 0.3 μl, hME buffer 0.17 μl)。②反应程序：37℃ 20分钟, 85℃ 5分钟, 40C ∞。

　　延伸反应 ①反应体系：总体积9 μl，延伸SAP混合液2 μl，其中各延伸反应引物9 μmol/L, MassEXTEND 酶0.018 μl, 延伸混合物0.2 μl(hME buffer和50 μmd/ddNTP混合物)。②反应程序：94℃ 2分钟, 94℃ 5分钟, 52℃ 5分钟, 55个循环;72℃ 3分钟，4℃ ∞。

　　树脂纯化 每个延伸反应产物用3mg Clean Resin树脂纯化。

　　点样芯片 将纯化产物移至384孔Spectro CHIP芯片上，上机测定。

　　MassARRAY Analayzer质谱检测(MassARRAYTM 7K System为Sequenom公司产品)。

　　统计学处理

　　采用SPSS 11.0软件处理。FⅤ:C水平采用均数±标准差(±SD)，二组间均数应用t检验;VTE与FⅤ:C的相关性，用Logistic回归分析;APCR频率用卡方检验，P﹤0.05表示差异有统计学意义。

　　结 果

　　血浆FⅤ∶C水平和APCR

　　VTE 组FⅤ∶C水平显著高于对照组，二组比较，有统计学意义(P=0.008)。经Logistic回归分析，在去除年龄和性别混杂因素后，与VTE仍然有相关性(P<0.01)。VTE组APCR阳性13例(20.0%)，对照组3例(5.0%)，二组比较有统计学意义(P=0.012)。

　　GroupFⅤ∶CAPCRVTE108.03± 28.29**13/65(20.0)*Control81.33±28.153/60(5.0)*P≤0.012， **P=0.008, compared with control.

　　FⅤLeiden 检测

　　在PCR 扩增片段中, 有2个MnlI限制性内切酶的酶切位点, 可将该扩增片段切成248 bp 、101bp 、37 bp 3个片段, 若存在1691G→A 的突变, 则其中1个酶切位点消失,只有285 bp和101bp 2个片段。若个体为突变纯合子, 在琼脂糖凝胶电泳只出现2个片段; 若为杂合子, 则出现37bp、101bp、248bp、285bp 4个片段。所有病例及对照组电泳结果均显示为248 bp和101bp 2个条带, 提示被研究个体均无FⅤLeiden 型突变。

　　FⅤR306(FⅤCambridge或FⅤHong Kong)检测

　　在PCR 扩增的519 bp片段中，有1个BstNI I限制性内切酶的酶切位点, 可将该片段切成221 bp和298 bp 2个片段, 若存在1090A/G(FⅤHong Kong)和1091G/C(FⅤCambridge), 则酶切位点消失, 仅有519 bp 1个片段。纯合子突变只出现1个片段;杂合子突变则出现221 bp、298 bp和519 bp 3个片段。电泳结果均显示为221 bp和298 bp 2个条带 , 提示所有个体均无FⅤCambridge或FⅤHong Kong突变。

　　MALDITOF质谱检测技术检测FVAsp79His、FV I359T多态性

　　所有检测个体均未发现FVAsp79His (G409C)和FV I359T(T1250C)突变。

　　讨 论

　　PE和DVT共属于VTE，据欧美国家的流行病学资料显示，发病率高，病死率亦高。 FⅤ是凝血过程中的一个辅因子, 而APC 可使活化的凝血因子Ⅴ (activated FⅤ, FVa) 失活而调节凝血过程。有资料显示，血浆FⅤ:C水平升高，尤其活化蛋白C抵抗(activated protein C resistance， APCR)是VTE的重要危险因素[2,3]，而FⅤ基因某些多态性可产生APCR,使抗凝作用减弱,凝血作用增强,导致VTE的危险性增加[4-9] 。已知血浆FⅤ:C、FⅧ:C、FⅨ:C水平升高是血栓性疾病的危险因素，在回顾性研究中FⅤ:C水平升高VTE的相对危险度为1.3;而前瞻性研究的结果与之相近，为1.2[2,10]。本组研究中，VTE组FⅤ:C水平较对照组显著增加。

　　APCR现象是导致遗传性易栓症的主要原因。在西方国家[3]，约有20%60%的静脉血栓病人存在APCR现象。非选择性静脉血栓病人中发生率约为21%，在家族性静脉血栓病人中达50%～60%，而在正常人群中仅为5%。国内储海燕[11]等发现国人正常人APCR阳性率5.8%，DVT患者APCR阳性率16% ;Yanqing等[12]报告DVT患者APCR发生率16.7% ，而正常对照为5.0%，两者也具有显著差异。在我们的研究中，VTE组APCR阳性13例(20.0%)，对照组3例(5.0%)，与国内外的结果相近。因此提示APCR是VTE的主要危险因子之一。

　　国外研究显示，FⅤ基因多态性中，除FV Leiden与VTE有相关性外，其它多态性与VTE的关系尚未明了，且存在种族和地域差异[13]。RuizArguelles等[14]的小样本研究发现墨西哥Mestizo人血栓性疾病个体中APCR发生率为40%，而FV Leiden为10%, HR2 单倍型为28%, FV Hong Kong为2%, 未发现FV Cambridge 和 FV I359T 基因突变。亚组分析发现，在10例APCR个体中，FV Leide发生率为40%，HR2单倍型为30%，所有FV Leiden个体和27%的HR2单倍型显示APCR，其结论显示FV基因的这些多态性不是墨西哥Mestizos人群易栓症的主要原因。在中国汉族人群未发现FV Leiden突变，仅在1例急性心肌梗死患者和1例DVT患者发现R306G杂合子突变。在2例SLE发现HR2杂合子突变，说明这些多态性也不是引起中国易栓症人群的APCR现象的主要因素[12]。FVAsp79His和FV I359T多态性在国人中的分布尚未见报道。

　　本组研究中由于病例数多，来源不易，故对FⅤ常见的和已经报道的基因多态性FV Leiden、 FⅤCambridge、FⅤHong Kong、 FⅤAsp79His和FⅤI359T采用PCRRLFP和MALDITOF质谱检测方法进行检测，特别是MALDITOF质谱检测技术具有方便、经济、精确，而且可以对大样本、多个基因多态性同时进行分析的特点，虽经检测均未发现上述突变，也未发现新的突变者，提示以上FⅤ多态性和突变不是引起中国人DVT和PE的危险因素，同时也不是引起APCR的因素，支持APCR现象和FV Leiden是导致VTE的两种独立的危险因素的观点[15]。

　　【参考文献】

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　　11储海燕, 诸江, 王鸿利等. 上海地区深静脉血栓形成患者抗活化的蛋白C及FV Leiden突变的初步调查.中华血液学杂志, 1996;17：462-465

　　12Yanqing H, Fangping C, Qinzhi X, et al. No association between thrombosis and factor V gene polymorphisms in Chinese Han population. Throm Haemost, 2003; 89:446-451

　　13Rees DC, Cox M, Clegg JB, et al. World distribution of factor V Leiden. Lancet, 1995;346(8983):1133-1134

　　14RuizArguelles GJ, PobleteNaredo I, ReyesNunez V, et al. Primary thrombophilia in Mexico IV: frequency of the Leiden, Cambridge, Hong Kong, Liverpool and HR2 haplotype polymorphisms in the factor V gene of a group of thrombophilic Mexican Mestizo patients. Rev Invest Clin, 2004; 56:600-604

　　15Rodeghiero F, Tosetto A. Activated protein C resistance and factor V Leiden mutation are independent risk factors for venous thromboembolism. Ann Intern Med, 1999; 130:643-650