人胎盘组织源造血干/祖细胞的初步研究

　　作者：刘玉峰,张永卓,张传新,王叼　　作者单位：郑州大学医学院第一附属医院儿科，郑州 450052;1郑州市儿童医院血液科，郑州 450000

　　【摘要】 为了探讨足月胎盘组织源单个核细胞(human mature placenta tissue-derived mononuclear cells，hPTMNC)中CD34+细胞的体外增殖、分化能力，寻找新的造血干/祖细胞来源供临床应用，分别采用流式细胞术检测、造血干/祖细胞集落培养和体外无细胞因子长期培养的方法，测定胎盘组织源和脐血中的CD34+细胞及其亚群和集落形成单位的数量。结果表明：胎盘组织源CD34+细胞(2.74±0.61%)及其亚群CD34+/ CD38-细胞(2.46±0.42%)、造血干/祖细胞集落CFU-GM(186.90±24.52)和BFU-E(101.40±13.35)水平都较脐血CD34+细胞(1.73±032%)、CD34+/CD38-细胞(0.80±0.25%)、CFU-GM(136.90±25.15)、BFU-E(49.20±8.13)高;前者在体外无细胞因子培养条件下存活时间长，且细胞数量增加约2倍。结论：胎盘是胎儿期的造血器官，胎盘细胞成分更幼稚，是一种造血干/祖细胞移植的新的种子细胞。

　　【关键词】 胎盘组织

　　Abstract Clinical transplantation has indicated that cord blood (CB) can be used in the hematopoietic reconstitution in the children，but not well used in the adult patients because of the low cell amount. The present study aimed to explore the capability of proliferation and differentiation of the hematopoietic stem /progenitor cells derived from human mature placenta tissue (PT) in vitro，and to find a new source of hematopoietic/progenitor cells for clinical transplantation. CD34+ cells in human mature placenta tissue were isolated and characterized by using enzyme-digestion method and flow cytometry. A long culture system without cytokines was established with human mature placenta tissue-derived mononucleated cells and cord blood mononuclear cells. The number of nucleated cells was weekly counted in culture for 14 weeks. The number of CFC was counted in culture for 2 weeks. The results showed that the CFC yields(CFU-GM，186.90±24.52;BFU-E，101.40±13.35)and the percentage of CD34+cells (2.74±0.61%) and CD34+/CD38- cells (2.46±0.42%) in placenta tissue (PT) were higher than CFC(CFU-GM，136.90±25.15;BFU-E，49.20±8.13)，CD34+ cells (1.73±0.32%) and CD34+/CD38- cells (0.80±0.25%) in cord blood (CB). The MNCs from PT have shown more survival ability than the cells from CB in the long-term cell culture condition;and the cells from PT increased by 2 times. It is concluded that the placenta may be another hematopoietic organ in ontogeny. The cells from placenta were more juvenile，and may be favorable source for clinical stem cell transplantation.

　　Key words placenta tissue;cord blood;CD34+ cell;hematopoietic stem cell transplantation

　　胎盘中含有大量的造血干细胞已被证实，脐血中的大量与造血相关的因子经研究证实来自胎盘[1，2]，这些造血相关因子可以有效地对脐血造血干细胞进行扩增和提高脐血造血干细胞的植入能力。这些研究结果说明，胎盘是造血干/祖细胞的适宜的生存环境。研究证明，小鼠胎盘参与了胚胎期的造血[3]，基于此我们对足月胎盘的造血干细胞的数量和功能进行了实验研究。

　　材料和方法

　　标本

　　收集10份胎盘与其对应的脐血。

　　脐血

　　足月妊娠胎儿娩出后立即将脐带结扎，对其消毒后穿刺脐静脉，收集于加了抗凝剂的采血袋中，在24小时内完成细胞分离。

　　胎盘

　　收集完脐血后，尽量保持胎盘的无菌状态，切割胎盘的胎儿面组织成0.5-1mm3大小组织块，用无菌的敷料包裹。8小时内进行酶消化以收集细胞。

　　细胞因子和抗体

　　重组人干细胞因子(rhSCF)、重组人粒-巨细胞集落因子(rhGM-CSF)、重组人白细胞介素3(rhIL-3)均为美国Immunex公司产品。抗CD34、CD38单克隆抗体为Peprotech公司产品;EPO购自Chemicon公司。

　　主要试剂

　　牛血清白蛋白(BSA)、甲基纤维素、胰酶、EDTA、DMED、胎牛血清均购自美国Sigma公司。

　　单个核细胞的制备

　　脐血细胞(CBC) 脐血标本中加入等量的PBS液稀释后缓慢地加入到淋巴细胞分离液(Ficoll-Hypague，比重1.077;脐血∶分离液为2∶1)面上，常温条件下1 000×g离心30分钟，吸取中间层单个核细胞(MNC);用PBS液稀释为106/ml。

　　胎盘组织源细胞(PTC) 无菌条件下剪切胎盘胎儿面组织成0.5-1mm3的组织块，用消化液(025%胰酶+0.02% EDTA)37℃消化30分钟，用100目的细胞筛过滤，用PBS液洗涤并调节细胞浓度为1012/ml;淋巴细胞分离液分离并吸取中间层单个核细胞，用PBS液稀释细胞浓度为106/ml。

　　长期培养

　　在DMEM中加入30%的脐带混合血浆，10%胎牛血清和1%抗生素制备成细胞培养液。用该培养液调整单个核细胞浓度为2×106/ml，以10 ml分别加入25 ml的培养瓶中，置于37℃、5% CO2 培养箱中培养。每3天半量换液并每周进行细胞计数和细胞活性检测。

　　造血祖细胞集落培养

　　培养体系为: DMEM中含1%牛血清白蛋白(BSA)，1%甲基纤维素和重组细胞因子。细胞因子包括： rhSCF 50 ng/ml，IL-3 10 ng/ml，GM-CSF 10 ng/ml，EPO 6 U/ml。标本于24孔培养板中在37℃、5% CO2和饱和湿度下培养14天。每孔接种1 000个细胞，在倒置显微镜下直接计数，40个以上细胞为1个集落。

　　CD34细胞检测

　　采用双荧光标记法，即收集分离后的单个核细胞，用PBS洗涤，计数并调节细胞浓度为106/ml，分别与CD34、CD38单克隆抗体室温避光反应30分钟。PBS洗涤后进行流式细胞仪检测。

　　统计学处理

　　采用SPSS 10.0统计软件分析，数据用x±SD表示，组间比较采用配对t检验。

　　结 果

　　CD34+细胞的分析

　　胎盘组织、脐血中CD34+细胞及其亚群含量见表1。表1显示胎盘组织中CD34+和CD34+/CD38-细胞群含量均大于脐血，这提示脐血中的CD34+细胞有可能来自胎盘。 Table 1. Quantitation of CD34+ cells and subsets of CD34+ cells from PT and CB(略)

　　造血祖细胞集落的分析

　　胎盘源细胞和脐血源细胞CFU-GM、BFU-E有明显的区别(表2)。表2显示胎盘组织源单个核细胞产生的集落数量明显高于脐血源，说明胎盘组织中含有更多的造血干/祖细胞。Table 2. Colony formation of MNC from PT and CB (略)

　　长期培养的影响

　　采用不加任何细胞因子的含血清的培养液，长期培养从胎盘组织和脐血中收集的单个核细胞，结果见附图。由附图可以看出，在长达14周的培养中，脐血中的单个核细胞数量在第4周开始下降，而胎盘组织源单个核细胞在第10周时，细胞数仍然在上升，比开始时的细胞数约增加1倍。多次培养结果显示，脐血源单个核细胞在未加细胞因子的培养液中只能存活5-7周，5周后细胞活性及有核细胞数明显下降，出现成片的死亡细胞;而胎盘源细胞培养中，细胞可存活长达10-12周，并且有大量的基质细胞，呈成纤维样和梭形。

　　讨 论

　　自1989年世界上第1例脐血移植成功以来[4]，人们对脐血移植进行了广泛深入的研究。由于脐血中造血干/祖细胞数量少，临床应用受到了限制，主要应用于儿童。由于成人骨髓造血干/祖细胞与外周血造血干/祖细胞移植存在高度的病毒感染机会和随着年龄的增长造血干/祖细胞的增殖和分化潜能明显下降，因此成体造血干/祖细胞的应用也受到了限制[5]。故寻找新的造血干/祖细胞的来源是一个亟待解决的问题。本研究应用酶消化的方法，从胎盘组织中分离得到造血干/祖细胞，应用流式细胞仪分析显示: 胎盘源细胞较脐血源细胞含有更多的造血干/祖细胞。

　　最近，Alvarez-Silva等[3] 对小鼠胎盘造血功能的研究表明，在鼠胚胎发育过程中，胎盘造血干细胞数量最初为胎肝造血干细胞的2-4倍;在E9和E10胎盘中已有造血干细胞定居，而此时胎肝中还没有造血干细胞定居;在E12时达到高峰，E17时开始下降。研究还表明，造血干细胞来源于胎盘的绒毛膜间质而非胎盘的母体面组织。长期培养显示，胎盘组织中的造血干/祖细胞具有更高的自我更新和增殖能力，说明胎盘在胚胎发育中具有造血功能。

　　CD34+细胞被普遍认为造血干/祖细胞，根据其细胞表面标志CD38抗原的表达情况，又可分为CD34+/CD38+和CD34+/CD38-细胞两大亚群，CD34+/CD38- 细胞是更为原始的造血干/祖细胞，具有更强的自我更新、增殖和分化能力。对胎盘源细胞和脐血源细胞的研究表明，胎盘源细胞中含有更多的CD34+细胞、CD34+/CD38-细胞，且在体外长期培养和造血祖细胞集落培养中显示前者具有更高的自我更新、增殖和分化能力。这提示，脐血中的造血干/祖细胞有可能来自胎盘，且胎盘可能是在胎肝造血以前的造血器官。

　　胎盘可以分泌大量的细胞因子，曾风华等[6]研究表明，胎盘具有支持造血干/祖细胞生长的良好环境。1977年Burgess等[7]用制成的胎盘培养液证明了胎盘细胞可以分泌丰富的HGF。在胎盘源细胞体外长期培养中有大量的基质细胞生长。2000年Jaroscak等[8]报道了从胎盘组织中分离培养出贴壁细胞，对其表面标志研究发现，与骨髓间充质干细胞在细胞表面标志上无明显区别。2003年张毅等[9]报道了胎盘源贴壁细胞可以支持脐血CD34+细胞体外扩增，说明了胎盘组织中的间充质样干细胞具有支持造血干/祖细胞扩增的能力。所有这些都表明胎盘在胚胎发育中具备造血干/祖细胞生长的适宜环境，且进一步说明胎盘为一造血器官。

　　胎盘作为胎儿的附属物，是一个结构复杂的暂时性器官。以上研究表明胎盘细胞成分较幼稚，胎盘组织源造血干/祖细胞较脐血造血干/祖细胞具有更高的增殖和分化能力，并且来源广泛，方便易得，且污染机率小，故胎盘源细胞可以作为儿童和成年病人进行造血干/祖细胞移植的又一良好的种子细胞。

　　【参考文献】

　　1Ruggieri L，Herimfeld S，Broxmeyer HE. Cytokine-dependent ex vivo expansion of early subsets of CD34+ cord blood myeloid progenitors is enhanced by cord blood plasma，but expansion of the more mature subsets of progenitors is favored . Blood cells，1994;20: 436-454

　　2Kurata H，Takakuwa K. Tanaka K. Ex vivo expansion of hematopoietic progenitor cells in human cord blood: an effect enhanced by cord blood serum. Hematol Pathol，1995;9: 73-78

　　3Alvarez-Silva M，Belo-Diabangouaya P，Salaun J，et al. Mouse placenta is a major hematopoietic organ. Development，2003;130: 5437-5444

　　4Gluckman E，Broxmeyer HA，Auerbach AD，et al. Hematopoietic reconstitution of a patient with Fanconi’s anemia by means of umbilical cord blood from an HLA-identical sibling. N Engl J Med，1989;321:1174-1178

　　5Romanov YA，Svintsitskaya VA，Smirnov VN. Searching for alternative sources of postnatal human mesenchymal stem cells: candidate MSC-like cells form umbilical cord. Stem Cells，2003;21:105 -110

　　6曾风华，沈柏均，王红美等. 胎盘造血功能的初步研究 . 中华血液学杂志，2000;21: 291-293

　　7Burgess AW，Wilson EM，Metcalf D. Stimulation by human placental conditioned medium of hemopoietic colony formation by human marrow cells. Blood，1977;49: 573-581

　　8Jaroscak J，Smith T，Haynesworth S，et al. Preliminary characterization of the surface staining of placenta derived adherent cells : a potential new source of stroma for umbilicol cord blood (UCB) expansion .The American Society Of Hematology，December 1-5，2000 : 4348a

　　9张毅，何津，江小霞等. 人胎盘源贴壁细胞支持脐血CD34+ 细胞体外扩增. 中国实验血液学杂志，2003;11: 560 -564