三七皂苷对人骨髓造血细胞凋亡相关蛋白表达的影响

　　作者：陈小红,高瑞兰,郑智茵,钱煦岱,徐卫红　　作者单位：浙江省中医院，杭州 310006

　　【摘要】本文研究观察三七皂苷(PNS)对造血细胞促进凋亡相关蛋白(Daxx、Fas)和抑制凋亡的核转录因子(NFkB、c-Rel)表达的影响，探讨PNS促进造血细胞增殖，支持生长存活的作用机制。采用半固体集落培养法观察PNS对人骨髓红系、粒系祖造血细胞(CFU-GM、CFU-E)的增殖作用，台盼蓝拒染法观察细胞的存活率，涂片染色法观察细胞形态学的变化，用流式细胞术分析细胞凋亡状况。同时，用PNS 处理粒系HL-60、红系K562、巨核系CHRF-288和Meg-01 4种细胞株后，提取胞浆蛋白和核蛋白，Western 免疫印迹观察Daxx、Fas、NFkB和c-Rel蛋白的表达水平。结果发现： ①PNS能够刺激人骨髓红系、粒系祖细胞和HL-60等4种细胞株增殖。②HL-60等4种株细胞经PNS和饥饿处理后，活性良好，镜下未观察到凋亡的形态学特征;AnnexinⅤ分析也未见凋亡的阳性细胞。③Western blot结果显示，经PNS处理的4株细胞Daxx蛋白表达水平与对照相比，下降幅度分别为33.3%-61.5%;HL-60细胞本身表达Fas蛋白低下，PNS处理后也无明显下降，而K562、CHRF-288和Meg-01细胞Fas蛋白表达与对照相比，下降幅度分别为33.3%-71.4%。④ NFkB、c-Rel蛋白除HL-60细胞对PNS诱导无明显变化外，其余细胞均出现不同程度地增加，分别提高了2.0-2.7倍和1.5-2.3倍。结论： PNS在某种程度上能够抑制Daxx、Fas蛋白表达，而相应减少造血细胞的凋亡，同时也能通过上调NFkB、c-Rel转录因子，促进细胞增殖，并阻止半胱天冬酶(caspase)连锁链的活化而抑制造血细胞凋亡，这为PNS应用于临床治疗凋亡过度的疾病如再生障碍性贫血提供了可能性。

　　【关键词】 造血细胞

　　Abstract The study was aimed to investigate the action of Panax Notoginosides (PNS，extracted from notoginseng herb) on the expression of the apoptosis-related proteins (Daxx，Fas) and transcription factors (NFkB、c-Rel) in the hematopoietic cells and to explore the mechanisms of supporting cells to survive.The colony formation of CFU-GM and CFU-E in human bone marrow was assayed in the presence of various concentrations of PNS.The viability of cells was assayed by trypan blue and the changes of cell morphology were observed with microscope.The Annexin-V positive cells were detected by FCM.Three lineages of human myeloid HL-60，erythroid K562，megakaryoid CHRF-288 and Meg-01 cells were incubated in addition of PNS(10 mg/L)for 14 days.The nuclear or cytoplasm protein of cells was extracted and analyzed by Western blot with monoclonal antibodies against Daxx，Fas or NFkB，c-Rel.The results showed: (1)the proliferation on hematopoietic progenitor cells (CFU-GM and CFU-E) and four cell lines was promoted by PNS; (2) after the four cell lines were promoted by PNS and hungered through wiping off the sera，the viability of the four cell lines was high without significant morphological change and neither the detection of Annexin-V positive cells; (3) the expression of Daxx and Fas protein could be inhibited by PNS.Western Blot showed that Daxx in four cell lines treated by PNS were 33.3-61.5% lower than that in untreated controls.The Fas protein was also descended in three cell lines of K562，CHRF-288 and Meg-01 by 33.3-71.4% respectively，while Fas protein in HL-60 cells was no detectable difference after PNS treatment.(4) The transcription factors NFkB and c-Rel protein could be increased by PNS.The NFkB、c-Rel protein were also enhanced in three cell lines of K562，CHRF-288 and Meg-01 by (2.0-2.7) and (1.5-2.3)-fold respectively，while there were also no detectable difference in HL-60 cells after PNS treatment.It is concluded that PNS inhibites the expression of Daxx and Fas proteins，may decrease the apoptosis of the hematopoietic cells.The level of NFkB and c-Rel proteins can be enhanced by PNS，which not only stimulates the proliferation of cells，but also inhibits the activity of the waterfall of caspase and apoptosis of the hematopoietic cells. PNS may treat the disease with over-apoptosis of hematopoietic cells，as aplastic anemia.

　　Key words PNS; Hematopoietic Cell; Daxx; Fas; NFkB; c-Rel; aplastic anemia

　　细胞凋亡是一种程序性细胞死亡，与细胞增殖及分化一起维持着多细胞机体的稳态，具有重要的生理功能。近年来研究表明，再生障碍性贫血(AA)患者骨髓造血干细胞或祖细胞(CD34+)，及单个核细胞(MNC)凋亡增加，Fas和FasL表达也明显增高，提示AA患者的发病与Fas、FasL系统有关[1，2]。三七皂苷(PNS)是中药三七的主要活性成分，我们已报道了PNS能够刺激人骨髓红系、粒系造血祖细胞增殖和分化[3]，改善再生障碍性贫血小鼠的骨髓抑制并促进造血细胞增殖等[4]。本研究通过观察PNS处理前后对造血细胞凋亡相关的Daxx、Fas蛋白和核转录因子NFkB、c-Rel表达的影响，以探讨PNS促进造血细胞增殖，支持生长存活的作用机制，为临床应用提供可靠的理论依据。

　　材料和方法

　　药物

　　三七皂苷注射液半固体造血祖细胞集落培养及PNS刺激试验

　　将正常的人骨髓标本按本室已建立的方法作粒系祖细胞(CFU-GM)、红系祖细胞(CFU-E)培养，体系分别含粒-单核细胞集落刺激因子10 μg/L(Strathmann)或红细胞生成素2 000 U/L(麒麟鲲鹏中国生物药业)，再加20%小牛血清(杭州四季青生物工程公司)和3 g/L琼脂(Promega)的IMDM培养液。混匀后接种至24孔培养板，作3个复孔，均含105有核细胞/(0.5 ml•well)。细胞株HL-60、K562、CHRF-288和Meg-01细胞的集落培养同上述人骨髓，但不加造血生长因子，接种 5×104有核细胞/(0.5 ml•well)。上述体系均分别加入PNS，终浓度为0、5、10、20和50 mg/L。培养7天后计数CFU-GM(>40个细胞)、CFU-E集落(>8个细胞)和细胞株的集落(>20个细胞)。

　　人的造血细胞株液体培养及PNS诱导处理

　　用HL-60、K562、CHRF-288和Meg-01 4种细胞株作为靶细胞，常规培养在含10%小牛血清的IMDM中，选择小剂量PNS(10 mg/L)孵育细胞作为实验组，对照组不加PNS，培养2周后备用。

　　台盼蓝染色、形态学观察和Annexin V分析

　　取培养2周后的细胞作饥饿处理，再加入较高浓度的PNS(30 mg/L)刺激细胞2小时，然后分别作台盼蓝染色，计算细胞存活率。细胞悬液经离心涂片机制片，瑞氏染色，油镜下观察细胞形态。Annexin V分析在细胞悬液中加入Annexin V-FITC 5 μl。避光孵育30分钟，用流式细胞仪分析Annexin V阳性的凋亡细胞。

　　细胞浆蛋白和核蛋白的提取

　　取培养2周后细胞作饥饿处理，再加入较高浓度的PNS(30 mg/L)诱导细胞2小时后，离心弃上清，用冷PBS洗涤后，悬浮在缓冲液A中含蛋白酶抑制剂(Sigma): 亮抑肽酶(leupeptin)、抗蛋白酶(antipatin)、抑蛋白酶肽(aprotinin)和抑胃酶(pepstatin)，均为10 μg/ml，经振荡后破碎细胞膜，收集浆蛋白;将沉淀物即细胞核悬浮在含蛋白酶抑制剂缓冲液C中，超声波粉碎仪破碎细胞核，离心沉淀取上清收集核蛋白。加入蛋白质显色剂 (Bio-Rad) 测定浆蛋白和核蛋白浓度，分装，-70℃保存备用。由于需要较长时间诱导细胞株，故先用低浓度PNS(10 mg/L)作用14天，再用较高浓度PNS(30 mg/L)刺激细胞2小时，然后提取核蛋白。

　　Daxx、Fas表达和NFkB、C-Rel表达的Western blot分析

　　按本实验室已报道的方法[5]，将提取的细胞浆蛋白或核蛋白20 μg加入SDS凝胶加样缓冲液20 μl中，煮沸后，用7.5%的SDS-PAGE凝胶分离，电压100 V，电泳150分钟，然后将已分离的蛋白条带转移到PVDF膜上，用含1%牛血清白蛋白(BSA)的TBS-T缓冲液封闭60分钟，分别加入以下特异性抗体(Santa Cruz产品)包括Daxx(C-20)、Fas(C-20)、 NFkB(C-19)和C-Rel(C)，抗体终浓度0.5 mg/L，室温作抗原-抗体结合反应70分钟，经TBS-T缓冲液洗涤3遍后，分别加辣根过氧化物酶标记的山羊或兔二抗(Santa Cruz产品，1∶5 000稀释)作用45分钟，充分洗涤后，用ECL发光剂(Santa Cruz产品)作用1分钟，X线胶片曝光，显影后作图像扫描进行分析，同样实验重复3遍。

　　结果

　　PNS促进造血细胞增殖

　　PNS刺激正常人骨髓造血祖细胞的增殖作用在低浓度5 mg/L时就起效，10、20和50 mg/L时实验组集落数均明显多于对照组(P均<0.01)，CFU-GM、CFU-E的提高率分别为39.1%-41.9%和31.9%-35.3%，3组之间无显著差异。PNS对4株细胞的作用在低中浓度10、20 mg/L时最明显，CFU-GM、CFU-E的集落提高率分别为24.1%-30.2%和23.3%-31.7%，明显高于对照组(P均<0.01)。PNS在较高浓度50mg/L时的作用不如10、20 mg/L时明显(图1)。

　　PNS较长时间地处理后细胞存活率、形态学和AnnexinⅤ分析

　　4株细胞先经小剂量PNS(10 mg/L)诱导2周，作饥饿处理后，再加入较高浓度的PNS(30 mg/L)刺激2小时，然后取细胞作台盼蓝染色试验，结果显示在PNS处理前后4株细胞的存活率均在96%以上;显微镜下观察细胞形态无异常，未观察到凋亡的形态学特征，如染色质浓聚而形成致密的染色质团块，胞质空泡化，核固缩和破碎，及凋亡小体等;流式细胞术AnnexinⅤ分析也未见凋亡的阳性细胞，上述结果均提示细胞经PNS诱导和饥饿处理后仍保持良好的活性状态。

　　PNS对Daxx、Fas蛋白表达下调的作用

　　Western blot分析显示细胞的Daxx、Fas蛋白抗原分别与Daxx、Fas抗体结合反应的特异性条带，相对分子量为120 kD、45 kD，与Daxx、Fas蛋白相符。经PNS诱导后3个系列4株细胞的Daxx蛋白量均下降。经密度分析，与未经处理细胞相比Daxx蛋白表达分别下降了50%、58.3%、33.3%和61.5%。而Fas蛋白表达则不尽相同，HL-60细胞的Fas表达在PNS诱导前后无明显变化，而K562、CHRF-288和Meg-01 3株细胞则出现Fas表达下降，与对照相比分别下降了71.4%、33.3%和56.5%(图2)。

　　PNS诱导NFkB转录因子和c-Rel蛋白表达增高

　　NFkB、c-Rel 的Western blot显示，经PNS诱导后4株细胞均出现不同的特异性条带，相对分子量为65 kD、75 kD，与转录因子NFkB、c-Rel蛋白相符，其中在K562、CHRF-288和Meg-01 3株细胞中NFkB和c-Rel蛋白量均增加。经密度分析，与未经处理细胞相比NFkB蛋白表达分别增加了2.7、2.0和2.5倍;c-Rel蛋白表达分别提高了1.5、1.8和2.3倍，而HL-60细胞的NFkB、c-Rel蛋白在PNS诱导前后无明显变化(图2)。

　　讨 论

　　文献报道对PNS的研究较多集中在心血管系统，它具有强心、扩张冠状动脉、改善心肌代谢、抗自由基、抗凝、钙拮抗等作用，而在造血方面研究较少。王亚平等[6]报道，PNS在体外通过诱导红系、粒系分泌造血调节因子，间接地促进血细胞生成。邹丹等[7]报道，PNS可明显地对抗60Co γ射线照射小鼠的实验性骨髓抑制。我们以往的工作也显示，PNS不但促进CD34+造血干细胞增殖，使CFU-Mix集落形成增加，而且能够诱导CD34+细胞向粒系细胞定向分化[8]。盖云等[4]报道，PNS还能够改善免疫介导性再生障碍性贫血小鼠骨髓的抑制，升高外周血白细胞等。

　　上述实验结果都是从刺激造血细胞增殖方面研究所得，而PNS对细胞死亡、凋亡相关蛋白的研究未见报道。Philpott等[1]报道，AA患者骨髓CD34+细胞中凋亡的比率较正常的高得多，为(33.44±9.26)%比(7.86±0.79)%，而且凋亡比率高低与临床病情严重程度相关。在本研究中4株细胞经小剂量的PNS诱导、饥饿处理后，再加较高浓度的PNS刺激，细胞生长存活良好，形态学和流式细胞术、AnnexinⅤ分析也未见到凋亡的变化，提示细胞经PNS诱导和饥饿处理后仍保持良好的活性状态。对Daxx和Fas蛋白表达情况分析显示，4株细胞经PNS处理后死亡相关Daxx蛋白，表达水平分别下降了33.3%-61.5%。由于HL-60细胞本身表达Fas蛋白水平低，故PNS处理后未能见到明显表达受抑制的变化。而在本身表达水平较高的K562、CHRF-288和Meg-01 3株细胞，PNS的作用使促进凋亡的Fas蛋白表达水平明显下调，比对照下降33.3%-71.4%。转录因子NFkB、c-Rel蛋白除了HL-60细胞在PNS诱导前后无明显变化外，其余3细胞株均呈现不同程度的表达水平增加，分别提高了2.0-2.7倍和1.5-2.3倍。上述结果表明PNS在某种程度上能够通过抑制Daxx、Fas蛋白表达，而相应减少细胞凋亡;同时也能通过增加NFkB、c-Rel蛋白表达促进细胞增殖，并阻止半胱天冬酶连锁链的活化而抑制造血细胞凋亡，为PNS应用于临床治疗凋亡过度的疾病如再生障碍性贫血提供了可能性。

　　Fas诱导细胞凋亡的下游通路为Fas的死亡结构域(DD)，与Fas相关死亡结构域(FADD)蛋白相互作用诱导凋亡;FADD与Fas相互作用后活化细胞死亡蛋白酶caspase-8，使其活化成具有酶活性的蛋白酶，随之活化连锁链，导致细胞凋亡，即通过Fas-FADD-caspase-8轴诱导凋亡[9]。

　　Daxx本身无DD，但能调节Fas诱导细胞凋亡，Daxx同时加速caspase-3或caspase-8底物Bid活化，这样Daxx提高Fas的功能，调节细胞对Fas的敏感性。NFkB是具有多向性调节作用的核转录因子，其活化能够激活抗凋亡基因的表达(如TRAF1、2，c-IAP1、2，A1/Bfl-1，Bcl-xL等)，阻止caspase-8活化，从而切断caspase连锁链的活化，使细胞逃避凋亡[10]。因此本研究结果表明，PNS促进细胞增殖，支持细胞生长和存活的作用不但刺激增殖相关基因和蛋白表达，同时也涉及到抑制凋亡和死亡相关Fas、Daxx蛋白表达。

　　【参考文献】

　　1Philpott NJ，Scopes J，Marsh JC，et al.Increased apoptosis in aplastic anemia bone marrow progenitor cells: possible pathophysiologic significance.Exp Hematol，1995;23:1642-1648

　　2张祥忠，洪文德，彭爱华等.Fas-FasL系统及凋亡与再生障碍性贫血关系的研究. 临床血液学杂志，2002;15:11-13

　　3郑茵红，高瑞兰，朱大元等.三七总皂苷及其单体对人骨髓造血祖细胞增殖作用的研究.中国中西医结合急救杂志，2003;10:135-137

　　4盖云，高瑞兰，牛泱平等.三七总皂苷对免疫介导性再生障碍性贫血小鼠造血祖细胞的增殖作用.中国中西医结合杂志，2003;23:680-683

　　5陈小红，高瑞兰，徐卫红等.人参皂甙对红系、粒单系、巨核系细胞株的增殖及转录因子的诱导作用.中国中西医结合杂志，2001;21:40-42

　　6王亚平，牛宏，姜蓉等.三七总皂甙对红系祖细胞增殖调控机理的研究.解剖学杂志，1996;19:138-142

　　7邹丹，乔海灵，全宏勋等.三七皂甙对辐射所致小鼠骨髓抑制的对抗作用.中华放射医学与防护杂志，2000;20:413-415

　　8钱煦岱，高瑞兰，马珂等.三七皂苷对人骨髓CD34+造血干/祖细胞的增殖分化作用.中国实验血液学杂志，2003;11:120-123

　　9Chang HY，Yang X，Baltimore D，et al.Dissecting Fas signaling with an altered specificity death-domain mutant: requirement of FADD binding for apoptosis but not Jun N-terminal kinase activation.Proc Natl Acad Sci USA，1999;96: 1252-1256

　　10Baldwin AS. Control of oncogenesis and cancer therapy resistance by the transcription factor NF-kappaB. J Clin Invest，2001;107:241-246