WISp39基因对U937细胞增殖、凋亡和周期的影响
发表时间：2011-08-24 浏览次数：372次
作者：李玥莹,刘黎琼,杨晶,刘伟 作者单位：华中科技大学同济医学院附属协和医院干细胞研究中心,武汉 430022
【摘要】为了探讨一种新发现的p21调控蛋白WISp39对白血病细胞的增殖、凋亡和周期的影响，构建了WISp39的真核表达质粒pLenti6/V5WISp39，并导入了人髓系白血病细胞系U937细胞，转染后用定量PCR检测了WISp39表达的变化，用CCK8法测定细胞增殖活性，流式细胞术(FACS)检测细胞凋亡和周期的变化。结果显示： pLenti6/V5WISp39 转染48小时后，实验组中WISp39 mRNA表达上升了(5.5±1.2)倍，同时U937细胞的增殖明显受到抑制，抑制率为37.6%;进一步的分析表明，在实验时间内，WISp39表达的升高不能明显诱导U937细胞的凋亡，但G0/G1期细胞比例由(40.59±0.7)%上升到(49.79±1.1)%。结论： WISp39对于U937无明显的诱导凋亡作用，但通过对细胞周期的影响，使停滞在G0/G1期的细胞增多，从而抑制了U937增殖。
【关键词】 细胞增殖
Effect of WISp39 on Proliferation， Cell Cycle and Apoptosis of U937 Cells LI YueYing, LIU LiQiong, YANG Jing, LIU Wei, CHEN XiangJun, LI XiaoQing, DU Wen， HUANG ShiAng Center for Stem Cell Research and Application, Union Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430022, China
Abstract To investigate the effect of a novel p21modulating protein WISp39 on proliferation, apoptosis and cell cycle of leukemia cells, the plasmid pLenti6/V5WISp39 was constructed and transfected into the human myelocytic leukemia cell line—U937 cells. The expression of WISp39 was detected by realtime PCR at 48 hours after transfection, proliferation of U937 cells assayed by CCK8, apoptosis and cell cycle were determined by flow cytometry. The results showed that plasmid pLenti6/V5WISp39 could readily enhance the expression of WISp39 in U937 cells. A significant growth inhibition (37.6%) was observed in cells tranfected with pLenti6/V5WISp39, while the control plasmid pLenti6/V5lacZ showed little effect on U937 growth. Further analysis revealed that pLenti6/V5WISp39 did not show obvious apoptosis induction effect, but it could really regulate U937 proliferation via cell cycle modulation. Compared with pLenti6/V5lacZ, pLenti6/V5WISp39 resulted in increase of cells in G0/G1 phase by 10% at 48 hours after transfection. It is concluded that the WISp39 gene has no significant apoptosis induction effect on leukemic cells, but it can increase cells at G0/G1 phase via effect on cell cycle, thus inhibiting the U937 proliferation. This result means WISp39 gene can act as a negative modulator on tumour cells.
Key words WISp39; p21CIP1/WAF1; U937 cells; proliferation; cell cycle
J Exp Hematol 2007; 15(4):733-737
细胞周期依赖性蛋白激酶(CDK)抑制因子p21CIP1/WAF1，属于CDK抑制物的Cip/Kip家族，是一个调控细胞周期与凋亡平衡的结点分子。p21CIP1/WAF1基因编码的蛋白主要抑制cyclin/CDK2复合物和负调节细胞周期进行，还可以结合增殖性细胞核抗原(PCNA)阻碍DNA合成。它与CKD2等因子结合并抑制其活性，使损伤的细胞停滞于G1期,抑制DNA复制和有丝分裂,从而使受损的细胞有充分的时间修复,不能修复的则发生凋亡。除了对细胞周期的调控作用，p21还参与了细胞进程中的分化、衰老和凋亡。它参与细胞的多种功能活动，与肿瘤发生、发展有关，在肿瘤细胞生物学中的地位令人瞩目。最近发现一种新的p21调控蛋白—WISp39,它是一种三十四肽重复单位(tetratricopeptide repeat, TPR)蛋白,可以同时结合p21和HSP90,在体内形成一个三聚复合物。WISp39通过阻碍蛋白酶体对p21的降解从而稳定新合成的p21[1,2]。目前，WISp39的具体生物学功能还不清楚，本研究探讨了WISp39对白血病细胞U937细胞周期、凋亡和增殖的影响，以期初步了解其在血液病肿瘤的作用机制。
主要试剂
Deep vent高保真聚合酶,购自NEB公司，PCR引物序列由上海英峻生物技术有限公司合成，真核表达载体pLenti6/V5试剂盒、Lipofectmine 2000和OptiMEMI购自Invitrogen公司，质粒提取试剂盒购自Omega公司;WISp39全长cDNA基因克隆购自ATCC公司，TRIZOL提取RNA试剂盒购自美国Gibco/BRL公司，逆转录试剂盒购自美国Fermentas公司，定量PCR试剂盒购自美国ABI公司，CCK8试剂盒购自日本同仁化学研究所，凋亡试剂盒购自奥地利 Bender Medsystem公司。
细胞培养
人髓系白血病细胞 U937为本室保存。按常规方法在含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液,于37℃、5% CO2、饱和湿度的孵箱中培养和传代。取对数生长的细胞进行分组处理。实验组：转染pLenti6/V5 WISp39的U937细胞;对照组Ⅰ：未转染的U937细胞;对照组Ⅱ：转染pLenti6/V5LacZ的U937细胞。于48小时离心收集细胞进一步做以下检测。
WISp39真核表达质粒的构建
根据GenBank数据库提供的WISp39基因mRNA全长序列和pLenti6/V5试剂盒说明书设计WISp39引物 (上游引物序列: 5'CACCATGGAGACGCCACCAGTCAA3';下游引物序列: 5'GCCAAACATCTTGCGCAGACC3')。PCR法扩增WISp39编码基因并在其两端填加平端连接位点，反应条件为94℃ 10分钟后接由94℃ 45秒, 55℃ 30秒, 72℃ 45秒三步组成的30个循环，最后72℃延伸10分钟。乙醇沉淀回收PCR产物。PCR产物和真核表达载体pLenti6/V5于室温下连接15分钟，连接产物转化E.coli One ShotStbl3TM感受态细胞，Amp抗性筛选阳性克隆并进行测序鉴定。
质粒转染
采用脂质体(Lipofectamine2000)转染法，在24孔板内接种对数期的人U937白血病细胞株,每孔约3×105个细胞，共3孔，将pLenti6/V5WISp39、 pLenti6/V5LacZ重组表达载体0.8 μg与2 μl脂质体分别用50 μl OptiMEMI重悬，再将两者混合，室温孵育20分钟后，每孔加入100 μl的复合物，另一组作为阴性对照，于37℃、5% CO2培养6小时后换液,孵育48小时,做进一步检测。实验重复3次，最后数据取3次的平均值。
WISp39 mRNA表达的realtime PCR检测
转染后48小时，收集上述3组细胞，以TRIZOL试剂提取细胞总RNA，按照逆转录试剂盒进行逆转录获得cDNA，反应体系即总RNA 1 μg，寡核苷酸引物1 μl，5×buffer 4 μl，RNA酶抑制剂1 μl ，10 mmol/L dNTP 2 μl ，MMLV 1 μl,反应条件为42℃孵育60分钟,72℃ 10分钟中止。按照定量PCR试剂盒配置PCR体系25 μl,包括2 μl cDNA，2 μl正向引物，2 μl反向引物,6.5 μl H2O; 12.5 μl Master Mix混合物，βactin为内参照。WISp39扩增的引物序列：上游5'ACCCTCCTACCGAAACG3';下游5'CCTCTGGCATCTGACTGG3';βactin扩增的引物序列：上游5'CCCTGGACTTCGAGCAAGAGAAT3';下游5'GTTTTCTGCGCAAGTTAGG3'。反应条件：94℃ 10分钟启动，94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸30秒，共40个循环;然后用定量PCR仪检测。
细胞增殖的CCK8测定
实验组和两组对照组U937细胞于转染6小时后换液，取1×104个细胞分别种植于96孔板中,每组设3个平行孔。于转染后48小时，加入10 μl CCK8,继续培养3小时,用酶标仪测定每孔A450 nm，A630 nm值，计算每组细胞增殖抑制率。
细胞的生长抑制率(%)=(1实验孔/对照孔)× 100%
细胞凋亡和细胞周期的流式细胞术分析
收集转染48小时的实验组和对照组U937细胞,用PBS洗涤2次,调整细胞浓度为1×106/ml.按AnnexinV细胞凋亡检测试剂盒说明处理细胞，进行AnnexinVPI标记，上流式细胞仪检测是否存在凋亡细胞及所占比例。另收集转染48小时的3组U937细胞，调整浓度为1×106个/ml,用PBS洗2次，用70%冷乙醇固定过夜, 1000rpm离心5分钟去乙醇,用PBS洗1次，去上清，加PI(碘化丙锭)染液(含RNase A)300 μl重悬细胞，4℃避光反应过夜,上机,测定细胞周期,观察G1期、S期、G2期细胞各占的百分比。
统计学分析
采用SPSS 11.5统计学软件处理，配对资料采用t检验，多组间均数比较采用单因素方差分析[3]数据以±SD表示。
结 果
WISp39基因的克隆及鉴定
将重组质粒pLenti6/V5WISp39做PCR检测，得到1.2 kb的WISp39 cDNA条带，用WISp39的上游引物和pLenti6/V5载体的下游引物联合做PCR鉴定，挑选正向连接重组体。送公司测序示正向连接重组体构建成功。将重组质粒pLenti6/V5WISp39做转化，提取并扩增质粒。
转染前后U937细胞WISp39基因表达的变化
转染48小时后，用Trizol提取 U937总RNA，反转录后用ABI SyBr green PCR MasterMix检测WISp39表达变化。结果表明，转染了pLenti6/V5lacZ的细胞中WISp39的mRNA表达与未转染的细胞无明显差异，而转染了pLenti6/V5WISp39 的细胞中WISp39的mRNA水平上升了(5.5±1.2)倍(。
WISp39对细胞增殖的影响
用CCK8法检测转染U937 48小时后细胞的增殖情况，每组细胞的OD值、抑制率见表1。转染pLenti6/V5LacZ的U937细胞与未转染U937 细胞相比，细胞增殖速度无显著性差异(p>0.05)，而转染pLenti6/V5WISp39重组质粒的U937细胞生长速度较对照细胞明显减慢(p<0.05)，这说明WISp39能有效抑制U937细胞增殖。
Table 1. OD value on A450nm， A630nm and the growth inhibitory rate of U937 cells(n=3)
CellOD valueInhibitory rate(%)U9371.228pLenti6/V5LacZU9371.147#pLenti6/V5WISp39U9370.716*37.6**p<0.05, #p>0.05, compared with untransfected U937 cells.
WISp39对细胞凋亡和周期的影响
转染pLenti6/V5WISp39及pLenti6/V5LacZ48小时后，凋亡细胞比例无明显变化(p>0.05,图2);FACS检测细胞周期的变化, 结果发现转染pLenti6/V5WISp39的U937细胞组G0/G1期的比例由对照组的(40.59±0.7) %上升为(49.79±1.1) %差异显著 (p<0.05)，凋亡率与pLenti6/V5LacZ转
讨 论
p21CIP1/WAF1，由p53依赖和不依赖的机制在转录水平上调节，蛋白酶体在翻译后水平进行调节，它不稳定，容易被蛋白酶体降解。WISp39，即p21(waf1/cip1)稳定蛋白39，它作为一个接头蛋白，并不增加p21蛋白合成的速率，而是延长了p21蛋白的半衰期，使p21的半衰期至少增加2.5倍[1]。WISp39通过召集HSP90侣伴蛋白，与新合成p21的N端结合，抑制p21的泛素化和随后蛋白酶体对p21的降解，从而稳定新合成的p21蛋白[2]。本研究通过构建pLenti6/V5WISp39载体，转染p53缺陷的白血病细胞系U937后，发现其生长速度明显低于对照细胞，流式细胞仪检测显示其主要阻滞于G0/G1期，无明显的促凋亡作用，说明其抑制U937细胞生长是通过G1期阻滞而发挥作用的，这些结果显示WISp39基因对U937细胞的作用与p21对U937细胞的作用是一致的。
已报道，p21可使 U937细胞株阻滞于G1期[4]。p21蛋白是细胞从G1期向S期转换的主要抑制因子。p21转染的细胞生长明显慢于对照组细胞，通过检测发现此时G0/G1期细胞增多，这表明生长抑制作用是通过G1期阻滞来实现的。关于p21是否直接参与细胞凋亡，目前有两种对立的观点，一种认为其表达增强只引起细胞周期运行的停止，不会启动细胞自杀程序[5];一种认为其表达增强与细胞凋亡有关[6]。然而p53才是凋亡的主要始动因子，p53突变株则不能转录激活凋亡因子Bax，DNA损伤诱发的凋亡需要的是有转录活性的p53而不是p21参与。本实验WISp39 转染p53缺陷的白血病细胞系U937未观察到有明显的促细胞凋亡作用。
细胞周期中有两个主要的调控点,一个位于 G1→S转折点,控制细胞从生长前期(G1期) 进入DNA合成期(S期);另一调控点位于 G2→M期转折点,是决定细胞一分为二的控制点。G1/S点是人类细胞增殖最重要的限制点,调节 G1/S期转化的调控因子主要为细胞周期蛋白D和E(cyclin D、cyclin E)、细胞周期蛋白依赖激酶 (CDK)以及 CDK的抑制因子(CDKI)。当cyclin与CDK结合形成酶复合体,使Rb蛋白发生磷酸化，释放转录因子E2F,促使细胞从G1期到S期，而 p21、p27、p57等CDKI可抑制这一过程使细胞停止在G1 期。同时，p21是DNA复制因子增殖性细胞核抗原(PCNA)的抑制剂,从而使 DNA复制受阻，这两方面的作用均使细胞生长停滞[7]。
本实验结果表明，WISp39的高表达尽管不能明显的诱导白血病细胞系U937细胞凋亡，但它能通过影响细胞周期，使G0/G1期的细胞增多，从而抑制U937的增殖。WISp39主要功能是通过阻碍蛋白酶体对p21的降解从而稳定新合成的p21，因此我们有理由相信此时 p21蛋白的积累参与了 WISp39处理细胞出现各种效应。此外，对于 p53缺失的U937细胞而言，无法通过 p53蛋白调控细胞周期阻滞和凋亡，而 p21蛋白表达的上调就显得更为重要。WISp39基因上调p21蛋白，抑制肿瘤细胞生长，提示它可作为肿瘤基因治疗的候选基因，具有重要意义。当然，WISp39与p21之间相互作用的具体机制和方式，以及对其他白血病细胞的影响还需要更深入的研究。
【参考文献】
1Jascur T, Brickner H, SallesPassador I, et al. Regulation of p21(WAF1/CIP1) stability by WISp39, a HSP90 binding TPR protein. Mol Cell, 2005; 17:237-249
2Benzeno S, Diehl JA. A novel WISp39 protein links HSP90 and p21 stability to the G2/M checkpoint. Cancer Biol Ther， 2005; 4:376-378
3刘林，张敏，邹萍等. PLK1基因沉默对K562/A02细胞周期、增殖和耐药性的影响. 中国实验血液学杂志，2006;14:241-246
4Asada M.Yamada T，lchijo H，et al. Apoptosis inhibitory activity of cytoplasmic p21(Cipl/WAF1) in monocydc differentiation. EMBO J， 1999;18：1223-1234
5Gorospe M，Cirielli C，Wang X，et al. p21(Waf1/Cip 1) protects against p53 mediated apoptosis of human melanoma cells. Oncogene, 1997;14：929-935
6Sheikh MS,Rochefort H,Gracia M. Overexpression of p21WAF1/CIP1 induces growth arrest,giant cell formation and apoptosis in human breast carcinoma cell lines. Oncogene ， 1995; 11：1899-1905
7Wang Y,Blandino G,Givol D,et al. Induced p21WAF expression in H1299 cell line promotes cell senescence and protects against cytotoxic effect of radiation and doxorubicin. Oncogene,1999; 18:2643-2649
