CIK细胞对白血病微小残留病作用的研究

　　作者：肖中平,封韬,王雪野,韩梅　　作者单位：吉林省人民医院血液风湿科，吉林 长春 130021 吉林省科技厅科研基金资助(200505251)

　　【摘要】目的观察CIK细胞对自体、异体原代白血病细胞的杀伤作用，对G0期CD34+白血病细胞的细胞毒作用，及对正常骨髓造血干细胞的影响。方法 取急性白血病(AL)化疗后、慢性粒细胞白血病(CML)慢性期及正常人外周血单个核细胞加入一系列细胞因子诱导培养CIK细胞，流式细胞仪检测CIK表型，G带法分析CIK细胞核型。冻存、复苏后作为靶细胞，MTT法测定CIK细胞对自体、异体原代白血病细胞杀伤作用。AO染色法测定复苏后G0期急性粒细胞白血病(AML) CD34+细胞比例及培养后CML CD34+细胞中G0期细胞比例。流式细胞仪检测CIK细胞杀伤前后G0期CD34+细胞比例变化。半固体培养法检测CIK细胞对正常骨髓CFUGM、BFUE集落形成的影响。结果 CIK细胞可从白血病患者外周血中获得，来源于正常淋巴细胞，对自体原代白血病细胞有明显杀伤作用，对G0期白血病细胞有明显抑制作用，对正常造血干细胞无杀伤作用。结论 CIK细胞可作为清除残留白血病细胞的有效工具。

　　【关键词】 白血病;微小残留病;CIK细胞

　　完全缓解的白血病患者体内，常残存耐药的、处于静止期的微小残留白血病细胞，是复发的根源。本研究从白血病患者外周血中培养出的CIK细胞，不含有白血病干细胞，能有效杀伤G0期CD34+白血病干细胞，而且这种杀伤作用具有选择性，不损伤正常造血干细胞，可以作为有效的免疫细胞来清除白血病患者体内的为微小残留病(MRD)，值得临床使用。

　　1 材料和方法

　　1.1 对象

　　本院血液科2005年1月至2008年10月15例急性白血病(AL)治疗后完全缓解(CR)患者，5例慢性粒细胞白血病(CML)慢性期患者，5例正常人。诊断均符合《血液病诊断及疗效标准》〔1〕。

　　1.2 试剂和仪器

　　白介素(IL)1，英国Pepro Tech INC公司;IL2，沈阳三生公司;CD3抗体，美国PharMingen公司;干扰素(IFN)γ，英国Pepro Tech INC公司;CD3FITC单抗、CD56PE单抗、CD34APC单抗、IgGFITC单抗、IgGPE单抗，美国PharMingen公司;EPICS XL流式细胞仪，美国贝克曼库尔特公司。

　　1.3 方法

　　1.3.1 CIK细胞的培养与测定

　　(1)CIK细胞的诱导与培养：取15例AL化疗后CR患者、5例CML患者、5例正常人外周血分离单个核细胞，第1天加入IFNγ 1 000 μl/ml,第2天加入CD3单抗50 ng/ml、IL2 1 000 μl/ml、IL1 100 μl/ml，诱导培养CIK细胞。(2)流式细胞仪(FCM)检测CIK细胞表型：在培养至第1、2、3周时，分别取105 CIK细胞，标记CD3FITC单抗、CD56PE单抗20 μl，对照管加入IgGPE、IgGFITC 20 μl，避光孵育20 min，用PBS洗涤后，再加1 g/L多聚甲醛固定，4℃避光保存，1 w内上机检测。(3)染色体G带法分析CIK细胞核型：取4例CML 患者、1例APL患者外周血单个核细胞培养至第3～4周CIK细胞5 ml(1×106/ml),加秋水仙胺至终浓度0.03 ng/ml,置于37℃、5% CO2孵箱中培育3 h后离心、低渗处理、预固定、离心、固定、离心、再次固定、离心、再固定，制备中期染色体标本，Gimsa 染色后镜检及摄影。

　　1.3.2 CIK细胞对急、慢性白血病细胞的杀伤作用

　　(1)靶细胞(白血病细胞)制备：取上述患者初诊时骨髓5 ml，肝素抗凝，以RPMI 1640按2∶1体积混合稀释，将此稀释液缓慢加入含有5 ml Ficoll的离心管中，2 000 r/min离心20 min后吸取单个核细胞层，以RPMI 1640清洗2次后，用含20%胎牛血清和10%DMSO的1640作为冻存保护液，程序降温至-196℃液氮中保存。(2)靶细胞(白血病细胞)复苏：从液氮中取出上述白血病细胞冻存管，迅速放入37℃水中，摇动使其尽快融化，吸出细胞悬液，注入离心管中，加入10 ml培养液混匀，1 000 r/min离心10 min，吸弃上清液，再重复用培养液洗1次;培养液稀释细胞至1×106/ml，接种于培养瓶中，培养1～2 d，培养后台盼蓝拒染法计数活细胞>95%后备用。(3)MTT法测定CIK细胞对原代急慢性白血病细胞杀伤作用：将白血病细胞浓度调至1×105/ml，效应细胞即CIK细胞浓度分别调至2×106/ml，5×105/ml，1×105/ml，即效靶比分别为20∶1、5∶1、1∶1。取96孔无菌培养板，实验组加效、靶细胞各100 μl，靶细胞对照组(白血病细胞)加靶细胞、培养液各100 μl，效应细胞对照组(CIK细胞)加效应细胞、培养液各100 μl(每组设3个平行孔)，置于37℃、5% CO2孵箱中培养4 h。孵育后，各孔加入MTT比色液20 μl,再置于37℃、5% CO2孵箱中培养4 h。孵育后，1 500 r/min离心10 min，弃上清，各孔加入DMSO有机溶剂150 μl，微量振荡器轻微振荡，待沉淀物充分溶解后，在酶联免疫监测仪上检测，按以下公式计算CIK细胞杀伤活性：

　　杀伤活性(%)=1-(实验组OD值-效应细胞对照孔OD值)/靶细胞对照孔OD值×100%。

　　1.3.3 CIK细胞对G0期CD34+急慢性白血病细胞的杀伤作用

　　(1)CIK细胞对G0期CD34+急性粒细胞白血病细胞(AML)的杀伤作用检测：取上述5例AML患者复苏后白血病细胞1×105/ml，按效靶比10∶1加入自体CIK细胞，在37℃、饱和湿度条件下作用4 h，同时设置阴性对照组。将上述2组细胞标记CD34APC单抗后，甲醛固定2 h后，加入AO染色液2 ml在冰浴条件下染色10 min后上机分析。(2)CIK细胞对G0期CD34+慢性白血病细胞的细胞毒作用 ①直接免疫磁珠法富集CML患者的CD34+细胞 取上述5例CML患者肝素抗凝骨髓5 ml，经淋巴细胞分层密度梯度离心分离，将BMMNC悬浮于含5 mmol/L的EDTA 500 μl PBS中，先加入非特异性结合阻断剂100 μl,6℃孵育20 min，缓冲液洗涤后悬浮于500 ml PBS中备用。将MiniMACS分离柱置于永久磁场的分离器上，以500 μl缓冲液洗柱后，将细胞悬液加于柱顶，然后以500 μl缓冲液洗柱4次;将分离柱移出磁场，加1 ml缓冲液于柱顶，加压使CD34+细胞洗脱下来，离心，重悬于100 μl。取样计数细胞，取富集后CD34+细胞1×105/ml，加入10 μl CD34单抗，避光孵育20 min，洗涤后通过FCM检测。②体外培养法选择CML白血病细胞：将富集的CD34+细胞以H5100调至1×106/ml,在37℃、保和湿度、CO2条件下培养3 d。③CIK细胞对CML CD34+干细胞中G0期细胞杀伤作用的测定 取培养后的CML CD34+细胞1×105/ml,按效靶比10∶1加入CIK细胞，在37℃、饱和湿度、5%CO2条件下作用下4 h，同时设置阴性对照组。将上述2组细胞标记CD34APC单抗后，甲醛固定2 h后，加入AO染色液2 ml，在冰浴条件下染色10 min后上机分析。

　　1.3.4 正常骨髓CFUGM、BFUE集落培养

　　一组取本院骨髓无转移的实体瘤患者(3例)BMMNC 5×104/ml种入含有GMCSF、GCSF、SCF、EPO因子甲基纤维素半固体培养基，放置于37℃、5%CO2孵箱中培养，第14天计数CFUGM、BFUE集落数量。另一组按效靶比20∶1加入培养的自体CIK细胞，第14天计数CFUGM、BFUE集落数量。

　　1.4 统计学处理

　　采用样本均数的t检验、方差分析。

　　2 结 果

　　2.1 CIK细胞的增殖

　　2.1.1 CIK细胞的增殖

　　随着培养时间增加，CIK细胞数量明显增多。

　　2.1.2 CIK细胞表型分析

　　来源于AL缓解患者、CML患者的CIK细胞，随着培养时间延长，CD3+细胞数量明显增加，第3周分别达到(98.09±4.12)%、(97.29±3.55)%，CD3+CD56+细胞数量分别达到(30.28±11.74)%、(31.64±8.52)%，与来源于正常人CIK细胞(35±5)%无明显差异(P>0.05)。

　　2.1.3 染色体分析

　　G带法检测来源于有染色体异常患者(5例)的CIK细胞均为正常核型，表明CIK细胞为非白血病源性。

　　2.2 CIK细胞对原代急慢性白血病细胞的杀伤作用。

　　2.3 CIK细胞对G0期CD34+原始白血病细胞的细胞毒作用

　　CIK细胞对G0期CD34+急性白血病细胞有明显细胞毒作用，平均杀伤率47%。CIK细胞对CD34+慢性白血病细胞有杀伤作用(图5、图6)，平均杀伤率66.73%。

　　2.4 CIK细胞对正常骨髓BFUE、CFUE集落形成影响

　　对照组与加入CIK细胞组的CFUGM集落数分别为150±16、145±20(P>0.05)，BFUE集落数分别为68±5、68±8(P>0.05)，表明CIK细胞对正常骨髓干细胞生长无明显抑制作用。

　　3 讨 论

　　近20年来，由于化疗、造血干细胞移植及靶向治疗的发展，急、慢性白血病的治疗取得巨大进展，白血病的CR率已有明显提高，急性白血病CR率可达60%～80%，大部分慢性期CML患者可获得细胞遗传学及分子生物学缓解，生存时间也明显延长，但白血病5年长期生存率仍只有20%～30%，大部分患者因复发而死亡。目前许多研究者认为CR期间体内MRD是复发的主要根源。MRD是指临床上达到CR，但体内仍有微量的、凭形态学方法无法检测到的白血病细胞残留。利用现代检测技术RTPCR、FISH、FCM证实了在完全缓解的急、慢性白血病患者体内存在MRD。如何去除MDR，提高白血病患者长期生存率成为人们研究的热点。化疗无法清除MRD，一方面由于残留的白血病细胞高表达gp170蛋白，多为多药耐药，对化疗药物不敏感〔2〕;另一方面有研究者通过分析增殖相关标记物Ki67及P120，发现只有16%的残留肿瘤细胞处于细胞周期中，大部分细胞静止于G0期，抵制化疗药物的杀伤，这些细胞一旦能够从G0期进入细胞周期，则持续增殖，导致白血病复发。目前治疗MRD尚无理想方法。

　　近年来人们逐渐认识到MRD的根除在很大程度上依赖免疫系统。异基因造血干细胞移植后移植物抗白血病(GVL)作用以及异基因造血干细胞移植后复发的患者，给予供者淋巴细胞输注(DLI)能达到再次缓解也证实免疫细胞对杀灭白血病细胞起着很重要的作用〔3〕。本实验探讨应用过继细胞免疫疗法杀灭残留白血病细胞的可行性。结果表明：①CIK细胞可从白血病患者外周血中获得，来源于正常淋巴细胞，能够在体外大量扩增，与来源于正常人的CIK细胞表型无明显区别。②CIK细胞对自体AL白血病细胞及CML白血病细胞均有明显杀伤作用。另外，CIK细胞能够杀伤异体白血病细胞，与对自体白血病细胞的杀伤率相比无显著性差异,提示CIK细胞以非MHC限制形式杀伤白血病细胞。③CIK细胞对G0期CD34+急慢性白血病细胞有明显细胞毒作用。④CIK细胞对正常骨髓造血干细胞无明显抑制作用。

　　【参考文献】

　　1 张之南. 血液病诊断与疗效标准〔M〕. 第2版. 北京：北京科学出版社，1998：336.

　　2 Filipits M，Suchomel RW，Zochbauer S，et al.Clinical relevance of drug resistance genes in malignant diseases〔J〕. Leukemia，1996;10：S107.

　　3 Collins R,Shpilberg O,Drobyski W,et al.Donor leukocyte infusions in 140 patients relapsed malignancy after allogeneic bone marrow transplantation〔J〕.J Clin Oncol,1997;15:43344.