脐血CD34+细胞体外扩增时HOXB4基因表达的变化

　　作者：唐宇宏,费小明,沈文怡　　作者单位：南京医科大学第一附属医院血液科，南京 210029

　　【摘要】同源盒基因家族成员HOXB4反映原始造血干/祖细胞(PHSC/PHPC)的自我更新和增殖能力。本研究采用实时定量RT-PCR的方法在mRNA水平上检测HOXB4基因的表达，以观察体外扩增脐血CD34+细胞自我更新的水平。结果显示：随着体外培养时间的延长，虽然CD34+细胞数增加，但HOXB4表达下降;周后，HOXB4几乎检测不到，与成熟外周血淋巴细胞表达HOXB4的水平相同;CD34+细胞与骨髓间充质干细胞(BM-MSC)共培养可以减缓CD34+细胞 HOXB4表达的下降。结论：脐血CD34+细胞体外扩增过程中自我更新能力逐渐下降。CD34+与BM-MSC共培养有助于减缓体外扩增的CD34+细胞自我更新能力的丧失。

　　【关键词】 脐血CD34+细胞

　　Abstract HOXB4，a member of homeobox gene family，is closely related to the self-renewing and proliferative ability of primitive hematopoietic stem/progenitor cells(PHSC/PHPC). This study was aimed to investigate the self-renewing level of cord blood progenitor cells (CBPC) expanded in vitro. The HOXB4 expression at mRNA level was assayed by using real time RT-PCR. The results indicated that as culture prolonged，the total cells，CD34+ cells greatly increased，however the HOXB4 expression gradually declined，even down to undetectable level similar to that of mature lymphocytes. Meanwhile，it was shown that CD34+ cells co-cultured with bone marrow mesenchymal stem cells (BM-MSC) could abate the decline of HOXB4 expression. It is concluded that the self-renewing potential of CD34+ cells gradually decreased during expansion in vitro， co-culture with BM-MSC was helpful to CD34+ cell expansion and slowed the loss trend of its self-renewal.

　　Key words HOXB4;cord blood CD34+ cells;ex vivo expansion;bone marrow mesenchymal stem cell;real time RT-PCR

　　脐血是造血干细胞(HSC)的重要来源，但脐血量有限，单份脐血HSC往往不能满足成年患者移植的需要。因此，许多人致力于体外扩增脐血造血干/祖细胞(CBSC/CBPC)的研究。既往研究表明，FL、TPO、SCF等可以促使原始造血祖细胞增殖，经2周的培养，CD34+细胞数量增加近百倍[1-3]。我们先前采用骨髓间充质干细胞(BM-MSC)共培养，CD34+细胞比值增加更为明显[4]，但对于体外扩增的CD34+细胞自我更新能力的水平并不清楚。

　　最近发现同源盒基因家族成员HOXB4作为一类转录因子，可正性调节HSC的自我更新 [5-7]。HOXB4在原始造血干细胞(PHSC)上高表达，随着PHSC向各系分化，表达水平逐渐降低，直至消失[8]。因此认为：HOXB4表达强弱能够作为一种衡量CD34+细胞自我更新能力的标志。本研究以实时定量RT-PCR的方法检测HOXB4的表达，探讨造血因子刺激的单纯培养及以BM-MSC为基质的体外扩增CD34+细胞能否维持其自我更新的能力。

　　材料和方法

　　主要仪器和试剂

　　Tripure Reagent (Roche，Germay)，AWV逆转录酶(Promega，USA)，TAQMAN荧光引物探针(Applied biosystems，USA)，TAQMAN PCR universal Master Mix (Applied biosystems，USA)，ABI Prism 7000 实时定量扩增仪 (Applied biosystems，USA)，

　　流式细胞仪(EPIC-XL Beckman coulter，USA)、G-CSF，TPO，SCF (Krin，Japan 惠赠)，FL(StemCell.Tech.Inc. Canada)，Ficoll 淋巴细胞分离液 (TBG，天津)，EasySepTM CD34+ progenitor separation kit (StemCell.Tech.Inc. Canada )，6孔培养板(Nunclon，Denmark)，StemSpanTM培养液(StemCell.Tech.Inc. Canada)、小鼠IgG1-PE，IgG1-ECD和小鼠抗人CD34-PE，CD45-ECD单克隆抗体(Immunotech，France)。

　　CD34+细胞的富集

　　8份脐血来自我院足月顺产健康产妇，无菌操作采集，ACD抗凝。脐血加入等量PBS混匀后，缓慢加入Ficoll上，400×g离心30分钟，收集单个核细胞(MNC)后，用EasySepTM磁珠分离出CD34+细胞，液氮冷冻保存备用。

　　MSC的培养和照射处理

　　MSC的培养方法参照文献〖9]。选第3或4代的细胞进行15 Gy的γ-射线照射，按1×105/孔接种于6孔培养板中，置CO2孵箱过夜，让其充分贴壁，即可与CD34+细胞进行共培养。

　　CD34+细胞的培养

　　在含TPO (100 ng/ml)、 SCF (100 ng/ml)、 G-CSF (100 ng/ml)、 FL (50 ng/ml)细胞因子组合的StemSpanTM培养液中，每份CD34+细胞分为两组进行体外扩增培养，一组以BM-MSC为基质，另一组无BM-MSC，将纯化好的CD34+细胞按2×104/孔接种于上述培养液中。然后置于37 ℃，5% CO2的培养箱培养。当细胞生长密度达到90%时进行分孔传代，分别培养7天和14天，收集各孔悬浮细胞计数。

　　CD34+细胞相对计数

　　应用流式细胞术分析扩增后脐血细胞的细胞表面标志。被测细胞用含1% FBS的PBS缓冲液调节至1×106/ml，加入小鼠抗人CD34-PE 和CD45-ECD单克隆抗体在室温下避光孵育20分钟，用流式细胞仪检测。以小鼠IgG1-PE和IgG1-ECD标记的细胞作为阴性对照。每次分析细胞2×104个细胞，得出CD34+细胞的比值。

　　细胞总RNA的抽提

　　各培养时段的CD34+细胞，加入Tripure，制备细胞裂解液，按照说明书进行细胞总RNA的抽提，采用相同方法抽提扩增前(第0天)CD34+细胞RNA作为HOXB4表达的阳性参照或标准品，外周血淋巴细胞RNA作为HOXB4表达的阴性参照。抽提的细胞总RNA溶于DEPC处理过的去离子水中，紫外分光光度计定量，取1μl进行1%琼脂糖凝胶电泳，确定无降解的RNA才能继续进行RT-PCR。

　　HOXB4表达的实时定量PCR反应测定

　　逆转录cDNA制备

　　取被测标本以及阴性对照的细胞总RNA 1 μg，用AMV逆转录酶制备cDNA，反应体系为20 μl，操作按说明书进行，cDNA产物可于-20℃保存。

　　PCR扩增

　　取制备好的各样本的cDNA 1 μl (cDNA数量级在1-20 pg之间)，加入 TAQMAN PCR Universal Master Mix 12.75 μl、 TAQMAN引物探针1.25 μl，再加去离子水使反应体系至30 μl，按ABI公司试剂说明书进行PCR反应。阴性对照(negative control)为成熟外周血淋巴细胞的cDNA ，NTC (no template control )为未加模板cDNA的空白管，每份样品设2个复管。

　　HOXB4标准品的制备 根据ABI公司的说明，用体外扩增前(第0天)富集出的CD34+细胞RNA制备cDNA作为HOXB4的标准品，逐级按100、101、102、103稀释cDNA，设其相对拷贝数分别为1×104、1×103、1×102、1×101，4 ℃保存备用。

　　数据的收集和统计学的处理

　　数据由ABI PRISM 7000 自带软件完成，通过相应的程序计算出所有标准品和样品的Ct值，根据标准品的Ct值绘制标准曲线，再由其计算出样本的相对拷贝数，利用SPSS软件进行统计分析。

　　结 果

　　CBSC的体外扩增

　　在含TPO，SCF，FL及G-CSF的无血清培养液，联合BM-MSC共培养条件下，CD34+细胞贴在MSC表面生长，细胞形态好(图1)，生长的速度较快，5天左右密度即可达到80%以上，以后每2天左右就需要分孔传代;而不含MSC的培养体系中，CD34+细胞生长的速度稍慢于共培养组，约7天左右细胞才融合到80%，以后每3- 4天能分孔传代。因MSC贴壁生长，培养完毕后收集悬浮细胞，计算显示：共培养组细胞总数的增加量，在7天和14天两个时间段均要多于非共培养组(表1)。CD34+细胞的比值根据流式细胞仪检测(图2)，计算得出，2周培养后CD34+细胞亦有较多增加(表1)。

　　CD34+细胞HOXB4的表达测定

　　细胞总RNA的抽提 应用Tripure裂解不同培养条件下体外扩增的CD34+细胞，抽提细胞总RNA，经电泳后观测，5份体外培养细胞可见清晰的28S，18S条带(图3)，说明RNA稳定无降解，可用于cDNA制备和HOXB4表达研究。其余3份标本细胞总RNA已有部分降解，不再进行RT-PCR的检测。

　　实时定量PCR HOXB4表达标准曲线的生成 按照ABI公司定量PCR实验步骤，我们以体外扩增前(第0天)的脐血CD34+细胞的RNA制备成的cDNA作为标准品，进行定量PCR，根据设定的相对拷贝数和分析软件生成的一系列Ct值(达到荧光阈值所需要的PCR循环数)，得到一条标准曲线，而样品经过相同条件的PCR循环扩增后亦会得到一系列Ct值，通过标准曲线就可以得到他们所分别对应的相对拷贝数(图4，5)。标准曲线中的HOXB4的拷贝数并非实际的表达量，而是根据第0天细胞设定的HOXB4表达量为基准，由Ct值得到的相应值。其实际含义是如果第0天细胞HOXB4的mRNA表达为104拷贝，而样品的相应拷贝数为103，则表明样品HOXB4的相对表达量为第0天的10%。

　　体外扩增CBSC的HOXB4表达测定

　　为了观察CBPC体外扩增后自我更新水平的变化，我们定量检测了有无BM-MSC为基质的不同培养条件和时间CBSC HOXB4的表达。结果显示，在无BM-MSC培养体系中，培养7天的CD34+细胞HOXB4的表达的相对拷贝数下降为1 783.55，仅约扩增前表达的18%，14天时表达的相对拷贝数只有295.51，为扩增前的3%(图5)，已与外周血成熟淋巴细胞不表达HOXB4的情况相仿。而在MSC共培养组CBSC扩增7天，HOXB4表达的相对拷贝数为4 577.86，达到扩增前的50%左右，培养14天，HOXB4表达才下降到19%。这说明单纯培养体系中CD34+细胞自我更新能力下降很快，BM-MSC共培养在一定程度上有助于维持自我更新的水平。为了进一步观察，我们又将其中一份细胞培养时间延长到21天和28天，结果发现随着培养时间的延长，HOXB4的表达进一步减低直到消失(图6)，而阴性对照和无模板对照均未检测到HOXB4的表达。

　　讨 论

　　既往许多研究表明，应用FL、SCF、TPO、G-CSF等造血细胞因子以及与BM-MSC共培养在体外扩增CBSC/CBPC，可使CD34+细胞迅速有效的增殖，有助于实验动物骨髓造血功能重建[1-3]。虽然TPO、FL、SCF等造血细胞因子被认为是作用于CD34+细胞的早期阶段，能促使CD34+细胞的增殖[1-3]，但是CD34+细胞体外扩增后是否真正保持自我更新的能力一直是我们关心的问题。最近有许多与HSC自我更新有关基因被发现，如HOXB4，Notch，Wnt等[10]，而HOXB4最为引人注目。HOX基因家族是一类细胞转录因子，最先因为在胚胎发育中的重要作用而被认识，之后人们发现它对成人造血系统中维持正常造血也起着非常重要的作用，其中HOXB4特异性表达于PHSC/PHPC，与PHSC的自我更新和增殖密切相关[4-6]。有实验证明，将HOXB4转导入HSC使之过度表达，这样的HSC可以进行连续移植，使得初级和次级受体小鼠的造血和免疫得到重建，经过HOXB4转导的HSC获得了选择性扩增的能力，增加了自我更新的几率。而且HOXB4过度表达不影响HSC正常的造血功能，也无诱导细胞恶性增殖的担忧[6，7]。Sauvageau等[8]证实，HOXB4在PHSC上高表达，并随着细胞向各系分化和成熟表达逐渐降低，直到没有表达。更有意义的是，HOXB4可能“招募”其他的血细胞使之成为干细胞，通过“强迫”某些成熟的造血细胞去分化(de-differentiate)而获得造血潜能[7]。由此可见，HOXB4与CD34+细胞自我更新是密切相关的，可以认为，HOXB4能够作为反映CD34+细胞是否具有自我更新能力的一种标志。

　　本研究应用TAQMAN荧光探针实时定量RT-PCR观察了体外扩增CBPC HOXB4的表达。该法特异性强，灵敏度高。我们以扩增前(第0天)CD34+细胞的cDNA作为标准品。同时，研究中所有被测样品均取和第0天标准品相同量的RNA制备成cDNA，这样可以更好地保证实验样本与标准品之间HOXB4表达的可比性，确切地反映CD34+细胞扩增前后HOXB4表达的改变情况。我们的结果表明，随着体外扩增时间的延长，虽然细胞的总数，CD34+细胞均有较大幅度的增加，而扩增的 HOXB4表达却下降了。

　　HOXB4表达下降在无BM-MSC培养组尤为明显。培养7天后，HOXB4表达仅为第0天的18%;培养14天，则下降到不足3%，甚至检测不到，类似于成熟外周血淋巴细胞，不再表达HOXB4。这些结果说明上述细胞因子虽然被认为作用于早期阶段的CD34+细胞增殖，但并不能使CD34+细胞保持自我更新能力。相比较而言，BM-MSC共培养组体外扩增的CD34+细胞增加倍数以及HOXB4的表达均较单纯培养组高。培养7天后，CD34+细胞可增加15倍，且HOXB4表达仍达扩增前的50%，这可能由于BM-MSC表达SCF、FL、TPO、LIF、IL-6等多种造血因子，而且共培养时和HSC胞体接触 不仅有助于CD34+细胞的体外扩增，而且有利于CD34+细胞自我更新能力的维持[9]。然而，培养14天后，虽然细胞总数及CD34+细胞继续增加，但HOXB4的表达却明显下降，只有扩增前的19%，而当培养到第28天，则完全检测不到HOXB4的表达，显示了随着培养时间的延长，CD34+细胞仍趋于分化成熟而丢失了自我更新的能力。可以认为CD34+细胞体外扩增的确是以“牺牲”其自我更新能力为代价的。目前来说，CD34+细胞体外扩增过程中，其细胞数量增加的同时又保持其自我更新能力几乎是不可能的。

　　【参考文献】

　　1Piacibello W，Sanavio F，Garetto L， et al. Differential growth factor requirement of primitive cord blood hematopoietic stem cell for self-renewal and amplification vs proliferation and defferentiation. Leukemia，1998;12 :718-727

　　2Yamaguchi M，Hirayama F，Kanai M， et al. Serum-free coculture system for ex vivo expansion of human cord blood primitive progenitors and SCID mouse-reconstituting cells using human bone marrow primary stromal cells. Exp Hematol，2001;29:174-182

　　3Kobari L，Pflumio F，Giarratana MC，et al， In vitro and in vivo evidence for the long-term multilineage (myeloid，B，NK，and T) reconstitution capacity of ex vivo expanded human CD34+ cord blood cells. Exp Hematol，2000;28:1470-1480

　　4费小明，陆化，吴雨洁等.人骨髓间充质干细胞对脐血干细胞体外扩增支持作用的研究. 南京医科大学学报，2004;24：235-238

　　5Sauvageau G，Thorsteinsdottir U，Eaves CJ， et al. Overexpression of HOXB4 in hematopoietic cells cause the selective expansion of more primitive populations in vitro and in vivo. Gene Dev，1995;9:1753-1765

　　6Antonchuk J，Sauvageau G，Humphries RK， et al. HOXB4-induced expansion of adult hematopoietic stem cell ex vivo. Cell，2002;109:39-45

　　7Antonuchuk J，Sauvageau G，Humphries R， et al. HOXB4 overexpression mediates very rapid stem cell regeneration and competitive hematopoietic repopulation. Exp Hematol，2001;29:1125-1134

　　8Sauvageau G，Lansdorp PM，Eaves CJ， et al. Differential expression of homeobox genes in functionally distinct CD34+ subpopulations of human bone marrow cells. Proc Natl Acad Sci USA，1994;91:12223-12227

　　9朱光荣，周小玉，陆化等.人骨髓间充质干细胞表达多种造血细胞因子. 中国实验血液学杂志，2003;11：115-119

　　10Pazianos G，Uqoezwa M，Reya T，et al. T The elements of stem cell self-renewal: a genetic perspective. Biotechniques，2003;35: 1240-1247