人β2-微球蛋白基因的克隆与原核中的表达

　　作者：孙万军,徐东刚,杜建芳,邹民吉,王金凤　　作者单位：军事医学科学院附属医院血液科，北京 100071

　　【摘要】本研究获取主要组织相容性复合体(MHC)Ⅰ类分子的轻链部分，即β2-微球蛋白(β2m)以制备MHCⅠ类分子-肽四聚体。根据已报道的序列设计特异引物，利用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法从人白细胞中克隆β2m的基因，并构建β2m的原核表达载体，在大肠杆菌中进行表达。结果显示： 构建的编码成熟β2m的pET-β2m可在大肠杆菌BL21(DE3)中高效表达β2m，表达量占菌体总蛋白的32%，β2m以包涵体的形式表达，经洗涤、变性后，以Sephacryl S-200 HR(S-200)柱层析纯化，纯度可达95%以上，纯化产物采用稀释法复性。Western blot分析表明，该蛋白具有与抗人天然β2m抗体反应的特性。结论：获得了高效表达人β2m的大肠杆菌工程菌株，建立了简便有效的β2m包涵体纯化、复性方法，为制备MHCⅠ类分子-肽四聚体奠定了基础。

　　【关键词】 β2-微球蛋白

　　Abstract Human β2-microglobulin (β2m) is the light chain of major histocompatibility complex (MHC) class I molecule. High-yield production of this protein is a prerequisite to the preparation of MHC class I tetramer. The present study was aimed to obtain recombinant human β2m expressed in Escherichia coli (E.coli) for preparing MHC class I tetramers. For cloning of human β2m gene，a pair of specific primers was designed based on the published sequence of this gene. A 300 bp specific DNA fragment corresponding to the encoding region of β2m lack of the signal peptide sequence was obtained by RT-PCR from the total RNA of human leukocytes. The amplified cDNA was inserted into the IPTG-inducible expression plasmid pET-17b by NdeⅠ and Bam HⅠ sites and its sequence was confirmed by DNA sequence analysis. The recombinant plasmid pET-β2m was transformed to the competent cells of E.coli BL21(DE3). The results showed that β2m was expressed in the form of inclusion body and amounted to over 32% of total cell proteins after IPTG induction. After washing with triton X-100 and urea，the inclusion body was dissolved with 4 mol/L urea and then purified with Sephacryl S-200 HR，and the final purity reached above 95%. The denatured protein was renatured by dilution method. Western blot assay indicated that the monoclonal antibody against human native β2m could react specifically with the recombinant protein. In conclusion，the human β2m gene was cloned successfully and expressed efficiently in E.coli BL21(DE3). This work establishes a convenient approach for renaturation and purification of large quantity of recombinant β2m. This provides the basis for the preparation of MHC tetramers.

　　Key words β2-microglobulin; MHC class Ⅰ; gene expression; gene clone

　　1996年Altman等[1]在世界上首创主要组织相容性复合体(MHC)Ⅰ类分子-肽四聚体技术(tetramer technology)，用于抗原特异性CD8+ T细胞的定量研究。近年来，该技术进一步发展成熟为研究抗原特异性CD8+ T细胞免疫特性的重要技术[2，3]，成为抗感染免疫研究、疫苗设计、肿瘤及自身免疫性疾病治疗等研究领域里不可或缺的关键技术。目前，MHC-肽四聚体技术已用于造血干细胞移植后巨细胞病毒感染、移植物抗宿主病、移植物抗白血病效应的监测。MHCⅠ类分子由1条高度多态性的重链和1条保守的轻链经非共价键结合而成，轻链即为β2-微球蛋白(β2-microglobulin，β2m)。因此，制备抗原特异性四聚体，除了需要某种特定的重链和抗原肽外，还需要大量纯化的β2m[4]。为此，我们从人白细胞中克隆了β2m基因，并构建了原核表达载体，在大肠杆菌BL21(DE3)中获得了高效表达，并对表达产物进行了纯化和鉴定，为制备MHCⅠ类分子-肽四聚体奠定了基础。

　　材料和方法

　　材料

　　E.coli BL21(DE3)和质粒pET-17b均为军事医学科学院基础医学研究所基因工程研究室保存。TRIZOL试剂、RT-PCR试剂、限制性内切酶NdeⅠ和Bam HⅠ、 T4 DNA连接酶、DNA凝胶回收试剂盒、质粒小量快速提取试剂盒购自Promega公司。淋巴细胞分离液(1.077 g/ml)购自Gibco BRL公司。Sephacryl S-200 HR(S-200)胶为Pharmacia公司产品。鼠抗人β2m单克隆抗体(mAb)及辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgG抗体购自武汉博士德公司。异丙基硫代-β-D半乳糖苷(IPTG)、尿素等为进口或国产分析纯试剂。

　　方法

　　人白细胞总RNA抽提及cDNA合成

　　取健康成年志愿者肝素抗凝静脉血3 ml，按常规方法以淋巴细胞分离液分离外周血单个核细胞，以TRIZOL试剂提取总RNA，直接进行逆转录反应。反应体积为20 μl。首先在6 μl DEPC水中加入2 μg总RNA，10 μmol/L Oligo(dT)1 μl，在70℃变性5分钟后置冰浴。再加入5×反应缓冲液4 μl，2.5 mmol/L dNTP混合物2 μl，40 U RNasin，及10 U AMV逆转录酶，42℃反应1小时后，于85℃温育5分钟终止反应，合成的cDNA即可用于PCR扩增或存-20℃。RNA完整性以1%琼脂糖凝胶电泳及扩增管家基因GAPDH进行验证。

　　PCR扩增β2m基因

　　根据GenBank中公布的人β2m的cDNA序列设计引物，为了便于在原核系统中进行高效表达，将编码N-端的20个氨基酸的信号肽序列剔除。上游引物为： 5’-ATATCCATATGATCCAGCGTACTCCAAAGATTCAG-3’，含起始密码子，NdeⅠ识别位点。下游引物为： 5’-GCGGATCCTTACATGTCTCGATCCCACTTAACT-3’，含终止密码子，Bam HⅠ识别位点。引物由上海博亚生物技术有限公司合成。PCR反应在20 μl体积中进行，以0.5 μl cDNA第1链为模板，反应条件为在94℃变性5分钟，然后94℃变性30秒，51℃退火30秒，72℃延伸30秒，共进行35次循环后，于72℃延伸5分钟。

　　2m表达载体的构建及测序鉴定

　　质粒提取、酶切、连接、转化和鉴定等，均按Sambrook实验手册进行[5]。将扩增的β2m基因片段回收后，以NdeⅠ和Bam HⅠ双酶切，与经相应酶切后的质粒pET-17b连接，转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞，涂板，挑克隆及小量扩增后，以碱裂解法提取质粒，双酶切法筛选接入β2m基因的转化子，从阳性克隆中提取质粒提交上海博亚生物技术有限公司进行测序。

　　β2m在E.coli中的表达、包涵体洗涤、溶解、纯化和复性

　　将含重组质粒的E.coli BL21(DE3)接种于含100 mg/L氨苄青霉素的LB培养基中，37℃培养过夜，然后以1%的比例转接，37℃培养至OD600为0.6-0.8时，加入终浓度为0.4 mmol/L IPTG;于37℃诱导4小时，离心收集菌体，以50 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0，含100 mmol/L NaCl，1 mmol/L EDTA，1 mmol/L DTT)重悬;在冰浴中以超声波破碎菌体，离心后分别收集上清和沉淀，其中沉淀部分(包涵体)以50 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0，含100 mmol/L NaCl，1 mmol/L EDTA，1 mmol/L DTT和2% Triton X-100)洗涤2次，以2 mol/L 尿素洗涤1次;再以4 mol/L 尿素变性溶解，以S-200为柱填料，对溶解上清液进行凝胶过滤层析;洗脱液为20 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0，含4 mol/L尿素，100 mmol/L NaCl)，上样体积为柱体积的2%，流速控制为0.5 ml/min，用自动收集器分管收集洗脱液，以十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定各管组份。纯化的样品在复性缓冲液(20 mmol/L Tris-HCl，含2.5 mmol/L GSH，0.5 mmol/L GSSG，0.1% PEG)存在的情况下，于4℃稀释复性48小时并结合透析法逐步降低尿素浓度，最后用PEG 20000缓慢浓缩。

　　SDS-PAGE

　　浓缩胶浓度为5%，分离胶浓度为15%，以考马斯亮蓝R250染色显示蛋白条带。

　　Western blot分析

　　蛋白样品以15% SDS-PAGE进行电泳，然后以15 V电压转移25分钟(Trans-Blot Semi-Dry Electrophoretic Transfer Cell，Biorad)，将蛋白转移至聚偏二氟乙烯膜(PVDF)，膜以封闭液(TBS，pH 7.5，含5%牛血清白蛋白和0.025% Tween 20)于37℃振荡封闭2小时，加入以封闭液稀释(1∶1 000)的鼠抗人β2m单克隆抗体，于37℃温育1小时，洗膜后加1∶1 000稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgG抗体于37℃温育1小时，洗去二抗后以4-氯-1-萘酚显色。

　　结果

　　人β2m基因的RT-PCR扩增

　　根据GenBank中公布的人β2m的cDNA序列设计引物，以人白细胞总RNA逆转录第1链cDNA 为模板进行PCR反应，扩增出1条与预计大小(300 bp)相符的DNA片段。

　　表达β2m的原核表达载体构建及鉴定

　　PCR产物经NdeⅠ和Bam HⅠ双酶切后，与同样酶切的pET-17b连接，转化BL21(DE3)，挑取单菌落抽提质粒，再以NdeⅠ和Bam HⅠ双酶切筛选接入β2m基因的阳性克隆，经测序证实插入序列为正确编码成熟β2m的基因(300 bp)，与GenBank中公布的序列完全一致。获得的表达载体称pET-β2m。

　　β2m在E.coli中的表达、包涵体纯化和复性

　　将构建的pET-β2m质粒转化BL21(DE3)，得到含重组质粒的基因工程菌。SDS-PAGE分析表明，该工程菌在未加IPTG诱导前无明显外源蛋白表达，经IPTG在37℃诱导4小时后，可表达相对分子量约12 kD的外源蛋白，该外源蛋白分子量与人β2m一致，经薄层灰度扫描分析，外源蛋白的表达量占菌体总蛋白的32%。而转入pET-17b空载体的E.coli在相同分子量部位无明显蛋白条带。菌体经破碎后分为上清和沉淀，可见重组蛋白以包涵体形式存在于沉淀部分。沉淀部分经洗涤、尿素溶解后，进行S-200柱层析纯化，纯化产物采用稀释法复性，SDS-PAGE分析仅显示了目的蛋白带，经薄层扫描，目的蛋白纯度可达95%以上。

　　重组β2m的Western blot分析

　　Western blot分析显示，含pET-β2m的工程菌表达的重组蛋白与抗人β2m抗体有特异性反应，而阴性对照(即转入pET-17b空载体的同一菌株)在IPTG诱导后，无任何特异性反应条带(图4)。

　　讨论

　　β2m最初从肾脏病患者的尿液中分离得到[6]，其主要生理功能是构成MHCⅠ类分子的亚单位。HLA-A2的晶体结构显示，重链分子的α3结构域和β2m折叠起来形成Ig样功能区[7]。研究表明，β2m对于MHCⅠ类分子在细胞表面稳定表达和有效呈递抗原肽必不可少[8，9]，并且β2m能促进抗原肽与细胞表面MHCⅠ类分子的结合[10，11]。

　　国内钱丽等[12]构建的人β2m原核表达载体在β2m的C端融合了His6标签，虽然便于采用Ni2+ NTA螯合物树脂对表达产物直接纯化，但在C端连接的6个组氨酸可能影响β2m的整体构象。在制备MHCⅠ类分子四聚体时，需要考虑β2m与MHCⅠ类分子重链、抗原肽形成的MHC单体分子应具有与天然的肽-MHC复合体相似的构象，如β2m末端引入外源氨基酸，将对MHC单体分子的构象造成影响，使最终获得的四聚体特异性发生改变。因此，我们在构建β2m原核表达载体时，以编码成熟β2m的cDNA序列本身的终止密码子及时终止转录，表达出的β2m不含外源氨基酸序列。此外，在获得β2m包涵体后，经洗涤、尿素溶解，以S-200柱层析纯化，即可获得高纯度的β2m重组蛋白，方法简便，因此无需为了纯化方便而加入His6标签。

　　国内何贤辉等[13]在克隆人β2m基因时，对其5’序列进行同义突变，保持氨基酸不变而降低了G/C含量，在E.coli BL21(DE3)pLyS中进行表达，重组蛋白约占菌体总蛋白的30%。作者认为，此优化措施是β2m在E.coli中获得高效表达的重要原因。我们结合本实验结果(重组蛋白占菌体总蛋白的32%)认为，β2m易在E.coli中获得高效表达的主要原因是β2m为仅有99个氨基酸的小分子蛋白。

　　包涵体溶解后便可进行纯化，实验室规模的纯化方法主要有凝胶过滤法、离子交换层析法以及高压液相法。凝胶过滤法主要是根据分子量的大小将不同分子量的蛋白质区分开，它具有设备简单、操作方便、样品回收率高和实验重复性好等特点。人β2m的分子量约为12 kD，根据分子量与层析介质孔径大小的对应关系，我们选用S-200作为填料，控制适当的流速洗脱，经鉴定目的蛋白的纯度可达95%以上，完全满足构建MHC-肽四聚体需要。

　　由于无合适的生物学活性测定方法对β2m进行鉴定，故利用鼠抗人β2m的单克隆抗体对获得的重组蛋白进行了免疫学鉴定。Western blot显示，含有重组质粒(pET-β2m)的E.coli BL21(DE3)在诱导后于相对分子量约12 kD位置处(与人β2m分子量大小一致)出现特异的反应条带，而转化空载体的E.coli BL21(DE3)中无任何阳性条带，此鉴定结果表明获得的重组蛋白为人β2m。

　　本研究构建的pET-β2m表达载体在E.coli BL21(DE3)中可高效表达人β2m，建立的纯化、复性方法简便有效，为进一步制备MHCⅠ类分子四聚体奠定了基础。

　　【参考文献】

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　　12钱丽，钱书兵，钱关祥. 人β2m基因的克隆及表达. 细胞与分子免疫学杂志，2001;17:384-385

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