浆样树突状细胞重建与单倍体相合造血干细胞移植的慢性移植物抗宿主病和复发关系研究

　　作者：吴继颖,黄晓军　　作者单位：北京大学人民医院，血液病研究所，北京 100044

　　【摘要】为了探讨浆样树突状细胞(PDC)在单倍体相合造血干细胞移植术后重建的特点及其与慢性移植物抗宿主病(cGVHD)和患者复发的关系，采用流式细胞术对19例白血病患者移植后外周血树突状细胞(DC)亚群晚期重建进行动态监测，并将其与患者cGVHD 和复发的关系进行分析。结果显示： 白血病患者髓样树突状细胞(MDC)、MDC1和DC百分比和绝对细胞数以及MDC/PDC比率均低于正常对照(P<0.05)，而髓样树突状细胞2(MDC2)、PDC百分数与对照组相比无统计学差异。患者移植后PDC比例于12月时达到正常(P=0.494)，而PDC绝对值和其余各亚群比例及数量均于移植后9月时恢复到正常水平，与对照组相比无统计学差异(P>0.05);MDC/PDC于移植后120天时已达到正常对照组水平(P=0.602)。发生cGVHD 患者移植后120天PDC比例高于未发生组 ;患者复发后MDC1比例及数值下降，而MDC2和PDC比例及数值略回升。结论：白血病患者单倍体相合造血干细胞移植前外周血DC比例、绝对数及MDC/PDC比率均减少;移植后MDC/PDC比率恢复较快 ;各亚群比例和数量在移植后9月后基本恢复正常;且恢复情况与慢性移植物抗宿主病发生和患者复发相关。

　　【关键词】 单倍体相合造血干细胞移植; 浆样树突状细胞; 慢性移植物抗宿主病; 白血病复发

　　Abstract To investigate the characteristics and significance of reconstitution of peripheral blood plasmacytoid dendritic cell (PDC) precursors after allogeneic human leukocyte antigen mismatched/ haploidentical hematopoietic stem cell transplantation, and its relationship with chronic graft versus host disease(cGVHD)and relapse， 19 patients with leukemia were enrolled for this study. Peripheral blood dendritic cell (DC) subsets of patients and healthy controls were detected by flow cytometry, and the correlations between reconstitution of DC and cGVHD, relapse were analyzed. The results showed that compared with healthy subjects, patients with leukemia had a significantly decreased proportion and absolute number of myeloid dendritic cell (MDC) , MDC1 , DC and the ratio of MDC/PDC (P<0.05). There were not statistically different in MDC2 and PDC between patients and healthy subjects. After transplant, all the proportion of WBC and absolute numbers of DC reached to healthy controls levels at 9 months (P>0.05), besides the proportion of PDC which reached to healthy controls levels at 1 year(P =0.494). Compared with levels before relapse, the proportions of MDC1, MDC, DC and the ratio of MDC/PDC were lower, but proportions of MDC2 and PDC were slightly higher after relapse. Patients with a 'high' PDC recovery profile had an improved cumulative incidence of cGVHD in contrast to patients with a 'low' PDC recovery profile on day 120 after transplantation (P=0.007). It is concluded that compared with healthy subjects, de novo leukemia patients have a significantly decreased proportion and absolute number of DC and the ratio of MDC/PDC before haploidentical hematopoietic stem cell transplantation; while ratio of MDC/PDC can be normalized with relative rapidity, the proportions of all DC subsets reached to normal levels on the whole at 9 months after transplantation, and also recovery level of DCs is correlated with occurrence of cGVHD and relapse.

　　Key words haploidentical hematopoietic stem cell transplantation; plasmacytoid dendritic cell; chronic graft versus host disease; leukemia relapse

　　目前同种异基因造血干细胞移植(allogeneic hematopoietic stem cell transplantation， AlloHSCT)供者主要为HLA完全相合的同胞或非亲缘供者(HLAmatched sibling donor, MSD or HLAmatched unrelated donor, MUD)，在一些应用HLA不完全相合供者的移植中，供者的T淋巴细胞绝大部分已在体外去除[1-4]。我们的研究已证实，GIAC体系(即G：粒细胞集落刺激因子， I： 强免疫抑制剂， A：抗胸腺球蛋白， C: 外周血与骨髓联合)不需要进行体外T淋巴细胞去除，急慢性GVHD发生率、移植相关死亡率、复发率，以及两年无病生存率和总生存率均与同期配型完全相合患者相似，从而使HLA不完全相合亲缘供者(HLAmismatched family donor, MFD)移植/单倍体相合造血干细胞移植(haploidentical hematopoietic stem cell transplantation)的方法得到改进，成功跨越HLA屏障，但我们这一体系成功的机制还未完全清楚[5-8]。树突状细胞(dendritic cells， DC)是专职的抗原呈递细胞(antigen presenting cells， APC),不仅能够显著刺激初始型T细胞(naive T cells)进行增殖, 充当机体免疫反应的始动者，而且可以通过调节T细胞的类型使机体产生免疫激活或免疫耐受[9];慢性GVHD的发生需要供受者APC共同参与[10-13]。此外，宿主APC是运输已致敏的供者T细胞和NK至靶组织所必需的。HLA完全相合造血干细胞移植后DC的重建可影响cGVHD和复发，HLA不合/单倍体相合造血干细胞移植后DC的晚期重建目前很少报道;未去T淋巴细胞模式下DC重建研究未见报告。对此我们进行研究，以了解DC重建与cGVHD、复发是否相关。

　　中国实验血液学杂志 J Exp Hematol 2007; 15(2)浆样树突状细胞重建与人类白细胞抗原不合/单倍体相合造血干细胞移植慢性移植物抗宿主病/复发关系初探

　　材料和方法

　　对象

　　患者 从2005年2月至2006年4月间，对在北京大学人民医院血液病研究所行HLA不完全相合单倍体移植的19位患者和12例健康亲缘供者进行研究。患者男性14例，女性5例，中位年龄21(12-51)岁。19例患者中急性髓性白血病5例，急性B淋巴细胞白血病6例，慢性髓性白血病7例，骨髓增生异常综合症/急性髓性白血病1例。 所有患者在进入研究前均签署知情同意书，供者标本在获取前均得到本人同意，本研究经医院伦理委员会审核通过。

　　供者 所有供者均为亲缘供者,移植前进行HLA配型，HLAA、B位点检测方法为低分辨方法,Ⅱ类抗原采用高分辨方法。依据HLA配型相合程度、年龄、性别以及健康状况选择供者。其中3/6个位点不合10例，2/6个位点不合7例，1/6个位点不合2例。

　　预处理方案

　　阿糖胞苷(cytarabine, AraC)4 g/(m2•d)×2天,马利兰(busulfan, Bu) 4 mg/(kg•d)×3天,环磷酰胺(cyclophosphamide, Cy)1.8 g/(m2•d)×2天,甲基环己亚硝脲(simustine, MeCCNU) 250 mg/(m2•d)×1天,抗人胸腺球蛋白(antihuman thymus globulin, ATG) 2.5 mg/(kg•d)×4天。

　　供者动员及造血干细胞采集

　　所有患者均接受供者经GCSF动员后采集的骨髓和外周血干细胞联合移植。所有供者接受重组人粒细胞集落刺激因子(rhGCSF)5 μg/(kg•d),连续皮下注射5-6天。第4天采集骨髓, 有核细胞要求达(3-4)×108/kg;第5-6天应用COBE血细胞分离机采集同一供者外周血干细胞,循环总量10 L,总单个核细胞达(3-4)×108/kg。

　　移植物抗宿主病预防和治疗

　　应用环孢菌素A+霉酚酸酯+短程甲氨喋呤方案。环孢菌素A 2.5 mg/(kg•d)静脉滴注,移植前9天至肠道功能恢复正常后改为口服，一般用至移植后9-12月;霉酚酸酯0.5 g每12小时1次，口服，移植前10天至植活后减半，后渐停药;甲氨喋呤移植后1天15 mg/m2，移植后3、6、11天10 mg/m2。cGVHD根据受累器官和广泛程度分为局限型和广泛型。局限型cGVHD 包括局限的皮肤损害和(或) 本病所致的肝脏损害。广泛型cGVHD 有下述二者之一加上另外4 项中任意3 项:①皮肤全身广泛受损; ②病理证实局部皮肤病变并兼有cGVHD 的肝损害。另外4 项包括:肝脏病理呈慢性重症肝炎或肝硬化,眼部干燥(Schirmer 试验湿度仅5 mm) ,唾液腺或口腔粘膜有本病病理,任何其他的靶器官受损 。发生cGVHD后根据情况加用皮质激素、CsA、MMF、FK506、依木兰等治疗。

　　植活监测

　　所有患者均于移植后6天始接受rhGCSF 5 μg/(kg•d),连续皮下注射至嗜中性粒细胞绝对计数(absolute neutrophil count, ANC)≥2.0×109/L。连续3天 ANC≥0.5×109/L被认为白细胞植入;脱离血小板输注7天,血小板≥20×109/L被认为血小板植入。移植后行骨髓形态学、遗传学检查、HLA DNA分型及DNA指纹图(北京市公安局物证所进行)检查证实供者植入情况,每例患者均采用2种或以上指标。

　　流式细胞术检测分析

　　单克隆抗体及其他试剂 抗CD14,CD19PerCP及阴性对照单克隆抗体，溶血素均购自美国Becton Dickinson公司;抗BDCA1PE( Mouse IgG2a, clone: AD58E71)、抗BDCA2FITC (Mouse IgG1, clone: AC1441)、抗BDCA3APC(Mouse IgG1, clone: AD514H121 )单克隆抗体均购自德国美天旎公司。

　　细胞表面标记 每管取新鲜抽取的EDTA抗凝血至少100 μl，分别加入各种抗体及阴性对照抗体10 μl ,4℃避光孵育15分钟;加溶血素2 ml室温避光10分钟，溶解红细胞;然后300×g离心5分钟,弃上清,用PBS将标记细胞洗涤2次;加入含1%多聚甲醛PBS 200 μl, 固定后24小时内上流式细胞仪检测。

　　流式细胞仪检测 流式细胞仪为FACSort型(Becton Dickinson 公司产品，装备双激光管)，应用Cellquest 软件进行数据分析。采用四色荧光标记活细胞膜，每份标本获取(1-2.5)×105个细胞，用FSC/SSC设门画出有核细胞群R1，以去除细胞碎片和死细胞;二维点图显示R1内细胞，设CD14、CD19 PerCP阴性细胞群为R2，显示R2群细胞,分析BDCA2 FITC阳性及BDCA1PE, BDCA3APC阳性细胞,即分别为PDC和MDC1、MDC2 ,并计算DC、MDC1、MDC2以及PDC占有核细胞的百分比。

　　统计学处理

　　实验数据应用统计软件SPSS 10.0进行分析，连续变量采用非参数MannWhitney U检验，cGVHD的发生率评估应用KaplanMeier曲线，P<0.05被认为具有显著性差异。

　　结 果

　　病人特点

　　19位患者和12例健康亲缘供者纳入本研究，HLA配型3/6不合10例，2/6不合7例，1/6不合2例。发生cGVHD 11例，其中局限型7例，广泛型4例;复发2例，死亡5例，余无病生存。

　　外周血DC前体细胞晚期重建

　　正常对照组和患者移植前的DC及其亚群 12例来源于健康供者的外周血标本被作为对照组。白血病患者预处理前MDC1、MDC及DC在白细胞中所占百分比较正常对照组明显减低，分别为MDC1 0.03% vs 0.435%; MDC 0.045% vs 0.645%和DC 0.125% vs 0.76% (P均<0.01);而MDC2 和PDC所占的百分比虽中位数亦低于对照组，分别为0.005% vs 0.035% 和 0.07% vs 0.135% , 但P>0.05，无统计学差异。各DC亚群的绝对值与百分比相类似，分别为MDC1 1.33/μl vs 26.7/μl; MDC 1.52/μl vs 35.56/μl 和 DC 7.89/μl vs 42.66/μl, 均较正常对照组明显减低，差异具有显著性(P<0.01);而MDC2 和PDC中位绝对数虽亦低于对照组，分别为0.15/μl vs 2.40/μl 和2.60/μl vs 8.5/μl， 差异亦无显著性(P>0.05); MDC/PDC比率为0.50 vs 4.21, 差异具有显著性(P=0.001)。

　　患者移植后DC亚群晚期重建 患者移植后晚期(移植后>100天)外周血DC各亚群的重建基本同步，各亚群在白细胞中所占比例随移植后时间推移逐渐恢复正常。如表2所示除移植后9月时PDC在白细胞所占比例为0.08%(0.04%-0.11%)，仍略低于正常对照组，两者有统计学差异(P=0.016)外，余各亚群所占比例均于移植后9月时恢复到正常对照水平，无统计学差异(P>0.05)。患者移植后晚期(移植后>100天)外周血DC各亚群数量的重建与比例重建基本相似，各亚群重建亦基本同步且亚群的数量与比例随时间推移逐渐恢复正常。如表3所示DC各亚群数量均于移植后9月时恢复到正常对照水平，与正常对照组无统计学差异(P>0.05)。MDC/PDC比率如前所述已于移植后30天时达到正常对照组水平，移植后晚期此趋势未出现改变，各时间点与正常对照组相比均无统计学差异(P>0.05)。

　　DC前体细胞晚期重建与cGVHD的关系

　　我们的研究显示，移植100天后所有患者的 cGVHD的累计发生率为57.89%(11/19)。移植后120天患者PDC中位绝对值为1.142/μl，我们以此值为分界点将患者分为高PDC组和低PDC组。高PDC组(PDC >1.142/μl) 9例患者中8例曾经发生 cGVHD，cGVHD的累计发生率为89.89% (8/9);低PDC组(PDC ≤1.142/μl)10例患者中仅有3例发生cGVHD，cGVHD的累计发生率为30 %( 3/10),明显低于高PDC组。应用KaplanMeier曲线进行分析，两组之间差异显著(P=0.007)。

　　我们对移植后120天的MDC/PDC也做了分组分析，结论和PDC相似，低MDC/PDC组cGVHD的累计发生率为明显低于高MDC/PDC组，但无统计学差异(P=0.068)。

　　Figure KaplanMeier plot of cumulative incidence of cGVHD by DC group at day 120 after transplantation. Log rank P=0.007.

　　患者移植后复发前后DC亚群变化

　　本研究过程中有2例患者出现复发，监测其复发前后外周血DC各亚群的变化，结果显示复发后各亚群比例及数量向患者移植前趋势转化。MDC1、MDC、总DC的比例及数量均较移植前下降，MDC2和PDC较复发前上升趋势。

　　讨 论

　　AlloHSCT是血液恶性疾病及代谢性疾病的有效乃至唯一治疗手段[5]。移植后供者造血系统、免疫系统在患者体内重建，这可使患者移植后达到完全治愈，但同时也可导致移植物抗宿主病等移植相关并发症，从而使移植的疗效受到严重影响[14]。众所周知，树突状细胞起源于骨髓CD34+造血干细胞，广泛分布于除脑之外的全身各脏器;DC在天然性和获得性免疫应答中均有重要的作用[9]，但DC在移植后发生的免疫事件中的作用未完全清楚[15]，关于DC的研究始终是移植免疫研究的热点，日益受到国内外学者的关注。人体内DC的研究由于其数量很少，仅占外周单个核细胞的1% 以下，且缺乏特异性表面标志而不易进行。目前，外周血前体DC的识别主要通过许多谱系抗体阴性(lin-)，如CD3、CD14、CD19和CD56阴性且HLADR、CD4 或CD33 阳性来实现。许多研究已证实，DC细胞并非单一的细胞群，至少可将其分为两群细胞，CD123bright CD11c- PDC和CD123dim CD11cbright MDC。最近的研究显示，CD1c (BDCA1), BDCA2, BDCA3和BDCA4 单克隆抗体可以快速、方便、有效地分离DC[16]，且其表达不被化疗及GCSF治疗下调[17]。

　　cGVHD 是alloHSCT后长期存活患者的主要并发症,不仅严重影响患者的生存质量,也是其非复发死亡的主要原因。在alloHSCT 后存活半年以上的病人中有60%-80%会出现cGVHD，尤其是非亲缘供者、HLA 不完全相合的亲属供者的异体外周血干细胞移植不断增加,以及非清髓移植后供者淋巴细胞的输注,使得cGVHD的发生率增加[18] 。cGVHD 的发病机理尚不完全清楚, cGVHD 可能为一种Th2 疾病, Th2 细胞可通过释放IL4、IL5、IL6和IL10等细胞因子,诱导B 细胞增殖分化产生抗体,发挥体液免疫效应, 在cGVHD 发病中都分别起主导作用[19]。Arpinati等[11]和Porta等[15]发现移植后6个月时，出现cGVHD的患者PDC数量明显减少， Clark等[10]和Lamb等[20]研究显示，cGVHD患者DC均来源于供者，而宿主来源的DC仅在无cGVHD患者中发现，这提示混合DC嵌合可能诱导耐受或无能;同时还发现移植后出现cGVHD的患者PDC数量明显增高,我们的研究结果与此相似。患者移植后cGVHD的累计发生率为57.89%(11/19)，将移植后120天患者PDC中位绝对值1.142/μl作为分界点将患者分为高PDC组和低PDC组两组。高PDC组(PDC >1.142/μl) 9例患者中8例曾经发生 cGVHD，cGVHD的累计发生率为89.89% (8/9);低PDC组(PDC ≤1.142/μl)10例患者中仅有3例发生cGVHD，cGVHD的累计发生率为30%(3/10),明显低于高PDC组，应用KaplanMeier曲线进行分析，两组之间差异显著(P=0.007)。

　　DC是专职的抗原呈递细胞，可以呈递具有细胞遗传学异常的白血病细胞，尤其是DC1，通过诱导Th1发育促进抗肿瘤免疫。白血病患者DC数量减少，尤其是DC1数量减少，导致肿瘤细胞获得免疫逃逸。Reddy等[21]发现植入时低DC数量与清髓和非清髓移植后复发相关;我们的研究显示，患者移植前DC各亚群在白细胞中所占比例及数量较正常对照组减低，尤其以MDC1减少明显;复发后患者各亚群在白细胞中所占比例及数量向患者移植前趋势转化——MDC1、MDC、DC及MDC/PDC较复发前下降，而MDC2及PDC较复发前略有上升，这提示复发可能与DC诱导抗肿瘤免疫减弱有关。

　　总之，随着HLA 不合/单倍体相合HSCT不断增加, 深入探讨各种移植合并症发生机制，将有助于新的预防及治疗方案的发现。

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