抗CⅡTA的核糖核酸酶P对Jurkat细胞 MHCⅡ类分子表达的抑制作用

　　作者：何飞,吴书林,孙明,郭荣　　作者单位：广东省人民医院心内科、广东省心血管病研究所，广州 510080; 1中南大学湘雅医院心内科，　长沙 410078; 2广东省人民医院血液科，广州 510080

　　【摘要】本研究旨在探讨抗MHCⅡ类分子转录激活因子(CⅡTA)的M1RNA抑制细胞表面MHCⅡ类分子的表达。 M1RNA 是核糖核酸酶P的催化活性单位，设计并克隆针对CⅡTA第3408位点的M1RNA(M13408GS)及其相应的CⅡTA靶基因片段(3176-3560)，分别插入pUC19、pGEM7zf(+)载体，进行细胞外切割活性筛选。将细胞外切割作用明显的M13408GS亚克隆入psNAV载体并稳定转染Jurkat细胞株，采用流式细胞术检测该细胞表面经典的MHCⅡ(HLADR、DP、DQ)类抗原表达，RTPCR检测其CⅡTA的mRNA水平。结果表明： 在重组人干扰素(IFN)γ诱导下， M13408GS阳性Jurkat细胞株与对照组比较，其表面HLADR、HLADP、HLADQ抗原诱导型表达分别降低了83.17%、94.12%及84.31%;同时CⅡTA的mRNA含量明显降低(P<0.05, t=4.89)。结论： 抗CⅡTA的M1RNA(M13408GS)降低了自身mRNA含量，从而阻止其调控的MHCⅡ类分子的表达。

　　【关键词】 MHCⅡ类分子转录激活因子(CⅡTA) 核糖核酸酶P(M1RNA) 移植免疫

　　Abstract This study was purposed to investigate the inhibitory effect of antiCⅡTA M1RNA on MHCⅡ expression. The M1RNA with guide sequences (GS) recognizing CⅡTA at 3408 site(M13408GS) and CⅡTA target RNA(3176-3560) were constructed, then cloned into the pUC19 and pGEM7zf(+) vector respectively . The recombinant M1RNA and its target RNA were incubated in cellfree conditions. It showed that M13408GS could exclusively cleave target RNA, then it was cloned into the psNAV vector. Stable transfectants of Jurkat cells with M13408GS were analyzed for classical MHCⅡ(HLADR,DP,DQ) induction in response to IFNγ by flow cytometry. The level of CⅡTA mRNA was measured by RTPCR. The results showed that after IFNγ treatment, the expression of HLADR,HLADP,HLADQ on M13408GS positive Jurkat cells decreased 83.17%, 94.12% and 84.31% respectively as compared with control. At the same time the mRNA contents of CⅡTA also markedly decreased (P<0.05, t= 4.89). It is concluded that anti CⅡTA M1RNA ( M13408GS) inhibits CⅡTA, decreases itself mRNA content and so suppresses expression of MHCⅡ molecules regulated by CⅡTA.

　　Key words MHC class Ⅱ transactivator (CⅡTA); RNase P(M1RNA); transplantation immunity

　　移植物抗宿主病或移植排斥是异基因造血干细胞移植的主要并发症，并影响其疗效。Ⅱ类主要组织相容性复合物(major histocompatibility complex, MHC)的表达分为组成型和诱导型。在同种异体移植中，抗原肽MHCⅡ类分子复合物首先激活CD4+T细胞，后者释放细胞因子，这些释放的细胞因子反过来又诱导原来没有MHCⅡ类抗原表达的细胞，使其表达MHCⅡ类抗原。更多的MHCⅡ类抗原阳性细胞反过来再被CD4+T细胞识别，形成一个逐级放大的环路，进一步使CD8+T细胞分化为细胞毒性T细胞，最终引起效应，导致移植物抗宿主病或移植排斥反应。因此，MHCⅡ类基因相容性显得尤为重要，其在异体移植中是较关键被识别的抗原[1，2]。母胎耐受的机制之一是其滋养层细胞表面MHCⅡ类分子诱导性表达被明显地抑制[3]，这与滋养层细胞MHCⅡ类分子转录激活因子 (MHC class Ⅱ transactivator， CⅡTA)的表达被关闭相关。此外，CⅡTA缺陷型心脏移植存活时间明显延长[4]。因此，通过下调CⅡTA以抑制MHCⅡ类分子表达，可能是诱导异基因移植免疫耐受的一种新策略。

　　中国实验血液学杂志 J Exp Hematol 2007; 15(3)抗CⅡTA的核糖核酸酶P对MHCⅡ类分子表达的抑制核酶包括锤头状核酶、发卡状核酶、核糖核酸酶P(RNase P)等。RNase来自大肠埃希氏菌， M1RNA是其催化亚单位，可催化水解反应，去除tRNA 5' 端的前导序列。锤头状核酶要求靶RNA必需有GUC序列，才能发挥最大的效应。而M1RNA 3' 端加上1个与靶mRNA互补的引导序列(guide sequence, GS),构建为M1GS RNA，即可识别和切割任何与GS形成互补的靶基因[5](图1A)。

　　我们曾经构建了能抑制MHCⅡ类分子表达的CⅡTA反义RNA[6]。该反义RNA对细胞表面MHCⅡ类分子的抑制率略低;另一方面，反义RNA的稳定性也比核酶差，不能重复利用。核酶的构建虽相对繁琐，但本实验室已掌握该项技术。本研究以抗CⅡTA的M1RNA抑制细胞表面经典MHCⅡ(HLADR、DP、DQ)类抗原的表达，为移植免疫的研究开辟了新途径。

　　材料和方法

　　质粒

　　pTK117(含有M1RNA编码序列)质粒由陈波斌博士提供[5]，pUC19、pGEM7zf(+)载体购自上海生物工程公司，腺相关病毒载体psNAV由陆华中博士提供。

　　试剂

　　限制性内切酶EcoRⅠ、SalⅠ、XhoⅠ及T4 DNA连接酶为美国MBI公司产品，异硫氰酸荧光素(FITC)标记的鼠抗人同型对照(IgG2a)、鼠抗人HLADR(IgG2a,k)、HLADQ(IgG2a,k)类单克隆抗体及重组人干扰素γ(IFNγ)均购自美国PharMingen公司，鼠抗人HLADP单克隆抗体(IgG2b, BRAFB6)系英国Cymbus公司产品。抗生素Geneticin(G418)及TRIZOL为美国GIibco公司产品。2×HiFi Master PCR kit购自上海生物工程公司，TITANIUMR onestep RTPCR kit购自美国Clontech公司。

　　细胞培养

　　人类T淋巴瘤细胞株Jurkat及B淋巴瘤Raji细胞系购自上海中科院生化细胞库。用含10%的热灭活胎牛血清(FCS，来自Hyclone)的RPMI 1640(Gibco BRL)培养液，置37℃、5% CO2、饱和湿度的培养箱中培养。

　　抗CⅡTA M1RNA的体外切割活性

　　M1RNA的构建 以pTK117质粒(含有M1RNA序列)为模板进行PCR反应，扩增带有抗CⅡTA(第3 408位点) 引导序列的M1RNA (M13408GS， 图1A)。上游引物：5'gcggaattcTAATACGACTCA CTATAG3' ,含有5'端EcoRⅠ酶切位点及T7启动子，便于克隆和体外转录;下游引物Olip3408： 5'acgcgtcgacGTGGTGCAGCTCGCTGATTACGCCAAGC3'，其中小写字母、下划线、黑体分别对应于SalⅠ酶切位点、ACCAC3' 、GS。此外，以同样方法克隆针对CⅡTA第452位点的M1RNA，命名为M1452GS。其上游引物序列与M13408GS相同，下游引物Olip452： 5'gaagatct GTGGTTCTTCCAGGACTGCCAAGCTTGC3'，小写字母、下划线、黑体分别对应于BglⅡ酶切位点、ACCAC3' 、GS(guide sequence)。按照2×HiFi Master PCR kit说明操作。将带有酶切位点的M13408GS(EcoRⅠ/SalⅠ)、M1452GS(EcoRⅠ/BglⅡ)分别双酶切，进而分别克隆入EcoRⅠ/SalⅠ、EcoRⅠ/BamHⅠ双酶切的pUC19载体,重新命名为pUC19M13408GS、pUC19M1452GS。

　　CⅡTA靶基因克隆 进行RTPCR反应克隆CⅡTA靶基因(3 176-3 560)，该模板仅包含M13408GS的切割点, 不包含M1452GS的切割点。上游引物： 5'ccgctcgagAGCTGAAGTCCTTGGAA3'，包含XhoⅠ酶切位点;下游引物： 5'gcggaattcGAACATGCCTGTCCAGAGC3'，包含EcoRⅠ酶切位点。通过RTPCR反应从Raji细胞系克隆CⅡTA模板(3 176-3 560)，参照TRIZOL说明书提取Raji细胞总RNA，所提取的总RNA经电泳可见明显的28s、18s两条带。按照TITANIUM onestep RTPCR kit使用说明，反应条件为： 50 μl体系中50℃反应1小时，94℃灭活5分钟，94℃ 30秒、65℃ 30秒 、68℃ 1分钟, 循环30次，72℃延伸7分钟。最后克隆入EcoRⅠ、XhoⅠ双酶切后pGEM7zf(+)载体, 命名为pGM3176。将该质粒转化大肠杆菌E.coli JM109，小量抽提该质粒，以备体外转录用。

　　体外转录及切割 EcoRⅠ线性化靶基因pGM3176; XbaⅠ线性化pUC19M13408GS及pUC19M1452GS。线性化产物用EndoFreeR Plasmid Maxi kit(Qiagen公司产品)纯化。按照Ribomax large scale RNA production systemT7(Promega公司产品)说明进行体外转录。将体外转录的M1RNA和靶RNA按一定比例混合，参照文献[5]进行体外切割及10%聚丙烯酰胺凝胶电泳。结果显示M13408GS切割效果明显(图1B)。

　　M13408GS的亚克隆

　　为将M13408GS 质粒插入psNAV 载体， 以EcoRⅠ/SalⅠ双酶切pUC19M13408GS， 胶回收M13408GS片段，与EcoRⅠ/SalⅠ双酶切后 psNAV载体连接(psNAVM13408GS，pA3408)，经DNA测序确认正确，并将pA3408转化大肠杆菌E.coli JM109，大量抽提该质粒备用。

　　Effectene介导的基因转染

　　pA3408质粒稳定转染Jurkat细胞株，按照Effectene转染剂 (Qiagen 公司产品)说明操作。 取6孔板，每孔接种2.5×105细胞，待细胞达到40%-80%汇合率时转染。取100 μl EC缓冲液稀释质粒(0.4 μg)，并加入增强剂(3.2 μl)，室温放置2-4分钟，随后加入Effectene(10 μl)混匀，室温静置7-8分钟，最后与含血清及抗生素的培养基(600 μl)混匀，立即加入6孔板常规条件下培养。

　　Jurkat细胞株经典的MHCⅡ类抗原表达的流式细胞仪检测

　　收集Jurkat细胞，调整浓度为1×106/ml，分别加入鼠抗人同型对照HLADR、HLADP及HLADQ单克隆抗体各10 μl，4℃孵育30分钟后，用PBS洗涤2次，再上流式细胞仪(Coulter公司产品)检测经典的MHCⅡ类分子的表达。结果以%表示，即每100个检测细胞中表达该类分子的细胞数。

　　CⅡTA mRNA含量的RTPCR检测

　　参照TRIZOL及TITANIUM onestep RTPCR kit的说明书进行RTPCR： 50 μl体系中50℃反应1小时，94℃灭活5分钟，94℃ 30秒、65℃ 30秒 、68℃ 1分钟, 循环30次，72℃延伸7分钟。CⅡTA引物(5'CCGCTCGAGGCTGCCTGGCTGGGATT3'; 5'GCGGAATTCCGATCACTTCATCTGGTCCTAT3'; 长度410 bp)。内参照反应体系中加入βactin引物(5'ATCATGTTTGAGACCTTCAA3'; 5'CATCTCTTGCTCGAAGTCCA3'; 310 bp)。

　　结 果

　　Jurkat细胞中MHCⅡ类抗原的表达

　　诱导前MHCⅡ类抗原的表达 Jurkat细胞HLADR、HLADQ均低表达，小于3%。HLADP阳性细胞较多，平均为26.76%。

　　诱导后MHCⅡ类抗原的表达 Jurkat细胞经IFNγ(40 ng/ml)诱导3天后，其表面HLADR、HLADP、HLADQ抗原表达明显增高，HLADP阳性细胞最多，平均增至41.78%; HLADR、HLADQ抗原表达亦有所提高(图2)。

　　M1RNA下调Jurkat细胞中MHCⅡ类抗原的表达

　　M13408GS阳性Jurkat细胞经IFNγ(40 ng/ml)诱导3天，表面MHCⅡ类抗原的表达见图2。与对照组比较，M13408GS阳性克隆表面HLADR、HLADP、HLADQ类抗原被显著抑制，抑制率分别为83.17%、94.12%及84.31%。

　　CⅡTA mRNA含量的RTPCR检测

　　RTPCR检测M13408GS阳性Jurkat克隆中mRNA呈诱导型表达，与对照组比较，其CⅡTA mRNA含量降低(87.11 ± 5.79)% (n=5， P<0.05, t=4.89)。

　　讨 论

　　同种异体细胞移植后，受者体内细胞因子网络失衡，一些细胞因子含量增多，如IFNγ等，使一些低表达或不表达MHCⅡ抗原的移植物细胞高表达该抗原。我们选用IFNγ诱导Jurkat细胞系3天，其表面HLADR、HLADP、HLADQ抗原表达确实增加，DP分子最为明显[7]。 CⅡTA参与MHCⅡ类基因的转录调控，但并不直接与MHCⅡ类基因调控区的DNA小盒结合，而是通过与RFX、X2BP和NFY等反式作用因子相互作用来调控MHCⅡ类分子的表达。本研究证实，CⅡTA基因与MHCⅡ类分子表达平行：未加入IFNγ时，Jurkat细胞低表达或不表达CⅡTA基因和MHCⅡ类分子;加入IFNγ诱导后两者表达同时增加。而且，转染空质粒的Jurkat细胞株经过IFNγ诱导后， HLADP分子表达增加更为明显，这与Jurkat细胞株表面诱导型DP分子表达的比较尚无统计学意义，并有待进一步实验探讨。

　　以纳米载体Effectene介导抗CⅡTA的pA3408转染Jurkat细胞，其表面经典MHCⅡ类分子的诱导型表达几乎完全丧失，同时RTPCR检测其CⅡTA mRNA诱导型表达明显减少，后者是其MHCⅡ类抗原对IFNγ诱导无反应的直接原因。这与Luder等[8]观点一致，弓形虫通过体内抑制小鼠骨髓巨噬细胞中CⅡTA诱导性表达，从而降低其MHCⅡ类分子的表达。而且体外辛伐他汀(simvastatin)及环孢霉素通过抑制CⅡTA的表达可以完全阻止人微血管内皮细胞MHCⅡ类的表达[9,10]。

　　核酶包括锤头状核酶、发夹状核酶和M1RNA等。前两者均要求靶序列中有GUC序列才能识别[11，12]，而M1RNA不受此限制，可以针对靶序列中任一位点，故选择范围较广[5]。国内尚无有关M1RNA的任何报道。本研究结合GenBank中已发表的人类细胞中RNA序列，排除它们之间的同源性可能后，选择CⅡTA基因的第3 408位点作为M1RNA切割的靶位点。该位点启始的C末端序列对其转录活化功能至关重要，而且其周围二级结构比较简单，核酶易于接近。M13408GS的引导序列设计为11个核苷酸，充分兼顾核酶与底物分子的结合、切割产物与核酶的解离以及核酶的专一性。M1RNA 5'端均含有1个TAATA盒(T7启动子)，将其克隆入psNAV载体(不含T7启动子)，转录因M1RNA自身的T7启动子而进行，以避免载体的附加序列，较客观地反映了其切割活性。本实验结果显示，仅M13408GS与CⅡTA靶序列体外切割产物电泳见预期切割条带。M13408GS通过抑制CⅡTA的mRNA含量，从而阻止其调控的MHCⅡ类分子的表达，这对移植免疫的研究具有重要的理论意义和实用价值。

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