β-连环素在白血病细胞株的异常定位研究

　　作者：时杰　王琳　胡丽华　　作者单位：华中科技大学同济医学院附属协和医院检验科，武汉 430022

　　【摘要】β-连环素是Wnt信号通路关键的信号传递子，其在细胞的异常定位引起下游靶基因的转录是多种实体肿瘤发生的原因之一。由于造血细胞缺少典型的黏着连接(adherens junction,AJ)，因此对β-连环素在血液肿瘤的表达及定位并无较多的研究。本研究探讨4种常见的白血病细胞株(Daudi, Jurkat, K562和Thp-1)中β-连环素蛋白的定位及β-连环素基因mRNA的表达水平，了解血液肿瘤中是否有β-连环素蛋白的定位异常，以期发现白血病新的发生机制，为寻找新的特异治疗靶点提供线索。用免疫细胞化学法检测β-连环素在白血病细胞系中的定位，用实时定量RT-PCR法测定β-连环素mRNA表达水平。结果表明：4种白血病细胞株有两种(Jurkat、Thp-1)存在β-连环素的异常定位，且β-连环素mRNA表达增高，但在Jurkat和Thp-1细胞中的β-连环素mRNA 低于Daudi和K562细胞。这4种白血病细胞株中β-连环素基因的mRNA表达水平与其异常定位无相关性。结论：β-连环素定位异常可能参与部分血液肿瘤的发生，引起β-连环素定位异常的机制并不是发生在转录水平。

　　【关键词】 β-连环素,白血病细胞株,Daudi,K562,Jurkat,Thp-1

　　Abstractβ-catenin plays a central role in Wnt signaling pathway. The aberrant localization of β-catenin in nucleus causes the transcription of down-stream target genes, which is the pathogenesy of some solid tumours. As the expression of adheren junction on hemopoietic cells is very low, there are a few studies on β-catenin expression in leukaemia. This study was aimed to investigate β-catenin localization and β-catenin mRNA expression levels in 4 leukemia cell lines so as to explore a new oncogenic mechanism and to find out a new therapeutic target. The β-catenin localization in leukemia cell lines was detected by immunocytochemistry, the β-catenin mRNA expression level was assayed by real-time quantitative RT-PCR. The results showed that there was aberrant localization of β-catenin in Jurkat and Thp-1, and β-catenin mRNA expression level was not increasd in these two cell lines, however, the mRNA expression levels of Jurkat and Thp-1 were lower than those of Daudi and K562. The β-catenin mRNA expression level was not correlated with β-catenin aberrant localization in these 4 cell lines. It is concluded that the aberrant localization of β-catenin may play a role in the development of some leukemia, and the mechanism resulting in β-catenin aberrant localization not take place at transcription level.

　　Key wordsβ-catenin;leukemia cell line;Daudi;K562;Jurkat;Thp-1

　　β-连环素(β-catenin)是Wnt信号通路关键的信号传递子，其在胞浆中的稳定、积累及进核是Wnt信号传递的重要步骤。它通过与胞核中DNA结合蛋白TCF/LEF的结合，共同调控一系列与细胞分化、增殖相关的基因(如c-myc、c-jun、cyclin D1[1]等)的表达。β-连环素在实体肿瘤中的作用已经得到了广泛的研究。已证实，β-连环素的异常表达与多种实体肿瘤(如结肠癌、肝癌、黑色素瘤[2-4]等)的发生、发展相关。也有研究证实，Wnt信号通路在造血干细胞的生长发育中起重要的作用[5]。因此白血病中也可能存在β-连环素的异常表达。为了解不同白血病细胞株的β-连环素的表达状态，我们通过免疫细胞化学和实时定量RT-PCR技术对不同白血病细胞株的β-连环素的定位及转录水平进行研究。

　　材料和方法

　　细胞培养

　　白血病细胞株 Daudi (人 Burkitt 淋巴瘤细胞系)、

　　Jurkat(急性T淋巴细胞白血病细胞系)、K562(慢性髓系白血病细胞系)、Thp-1(人单核细胞白血病细胞系)均购自华中科技大学同济医学院细胞库。所有细胞株均用RPMI 1640培养液(含10%胎牛血清)在37℃、5% CO2、饱和湿度的孵箱内培养。

　　主要试剂

　　兔抗人β-连环素抗体购自武汉晶美生物工程有限公司、SP免疫组织化学试剂盒、DAB显色试剂盒购自武汉凌飞生物技术开发有限公司，TRIzoL总RNA提取液购自Omega公司，逆转录试剂购自Promega公司，PCR试剂购自武汉天源生物技术有限公司，20×SYBR GreenⅠ染料购自上海复兴公司，兔抗人β-连环素抗体为Neomarks公司产品，辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG抗体为Santa Cruz公司产品。

　　β-连环素在白血病细胞株定位的免疫细胞化学检测

　　取Daudi、Jurkat、K562、Thp-1细胞悬液，分别移入10 ml离心管中600 ×g离心10分钟，弃上清，用PBS洗涤细胞1次，再用PBS重悬细胞，调整细胞密度105/ml以上，进行细胞涂片(载玻片经APES处理)，干燥后浸入-20℃预冷的甲醇中固定20分钟，风干后4℃保存。取正常人外周血Ficoll密度梯度离心法分离外周血单个核细胞，PBS洗涤1次，再用PBS重悬细胞，调整细胞密度105/ml以上，进行细胞涂片，作为正常对照组。取各组细胞涂片，以0.01 mol/L PBS漂洗3分钟，共3次;用0.3%过氧化氢/甲醇液室温孵育30分钟，以除去内源性过氧化物酶，用PBS漂洗5分钟，共3次;10%正常山羊血清室温下孵育10分钟以减少背景非特异性染色;弃去血清，不洗，加稀释的一抗，4℃湿盒内过夜，PBS漂洗5分钟，共3次;加入辣根过氧化物酶标记的通用型二抗，室温孵育30分钟，PBS漂洗5分钟，共3次;DAB显色，苏木素对比染色30秒，自来水冲洗。梯度乙醇脱水、二甲苯透明，以中性树脂封固。油镜下观察结果。

　　β-连环素mRNA表达水平的实时定量RT-PCR检测

　　利用SYBR GreenⅠ染料在LightCycle荧光定量PCR仪上检测β-连环素mRNA的表达。取5×106个细胞，用TRIzoL试剂提取总RNA，逆转录合成cDNA。参照文献[5]，设计引物，扩增产物为71 bp，以GAPDH为内参照，扩增产物为220 bp。引物由上海博亚生物工程技术服务有限公司合成，序列如下：β-连环素：Sense：5′-CCGCATGGAAGAAAT AGTTGAAG-3′;Antisense：5′-CAATTCGGTTGTG AACATCCC-3′(GenBank NM_001904);GAPDH： Sense：5′-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3′; Antisense： 5′-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3′;(GenBank AJ005371)。SYBR GreenⅠ是一种只与双链DNA结合的染料，当它与DNA双链结合时，发出荧光，从DNA双链上释放出来时，荧光信号急剧减弱。因此，随着PCR产物的增加，产物与SYBR GreenⅠ结合的量也增大，其信号强度代表了产物的量，并做融解曲线对PCR产物的特异性进行鉴定。优化的实时定量RT-PCR体系为：10×PCR缓冲液2 μl，25 mmol/L MgCl2 2 μl，10 mmol/L dNTP 0.4 μl，20×SYBR GreenⅠ 1 μl，10 μmol/L的引物各0.4 μl，2 U/μl的Taq酶 0.5 μl，cDNA 1 μl，反应总体积20 μl。反应条件：95℃ 3分钟，94℃ 5秒，54℃ 5秒，72℃ 10秒，共40个循环，80℃采集荧光信号。

　　标准曲线的制作

　　将一次逆转录的K562细胞cDNA分装，保存于-80℃，作为标准品。每次扩增时拿出1份K562细胞cDNA用水做10倍系列稀释，分别对β-连环素和GAPDH进行实时定量扩增，制作各自的标准曲线。横坐标相当于K562细胞的总RNA量，纵坐标为Ct值(指PCR扩增过程中，荧光信号开始由本底进入指数增长阶段的拐点所对应的循环数)。标准曲线相关系数r>0.99的定量结果认为可靠。根据各自的标准曲线，可以得出各个标本β-连环素、GAPDH的起始拷贝数。我们将β-连环素与GAPDH拷贝数之比的100倍作为标准化β-连环素(β-cateninN)，即β-连环素N=(β-连环素 mRNA拷贝数/GAPDH mRNA拷贝数)×100%。

　　结果

　　β-连环素蛋白定位分析

　　研究已知，β-连环素在造血细胞中可定位于胞膜和(或)胞浆，表达的强度可高可低，但无胞核的染色[5]，本研究的正常对照组仅有胞膜和胞浆的染色，与文献结果相同。在本研究中涉及到的几种细胞株中可观察到Jurkat、Thp-1胞核的强染色(为棕黑色)，Daudi、K562无胞核的染色，仅有胞膜和胞浆的染色(为棕黄色)，且不同的细胞染色的强度也有强弱之分。

　　标准曲线的建立

　　分别将β-连环素和GAPDH不同浓度的倍比稀释模板进行定量PCR，所得的定量标准曲线分别为CtGAPDH=-4.093 log(GAPDH拷贝数)+7.954、Ctβ-catenin=-2.711 log(hTERT 拷贝数)+17.99，相关系数分别为-0.99、-1.00。根据公式计算4种细胞株的标准化β-连环素(即β-cateninN)。

　　讨论

　　Wnt信号传导通路是一种既可影响基因表达又可影响细胞迁徙的信号通路。β-连环素是该通路中重要的信号传递子，其在胞浆内的稳定、积累及进核是Wnt信号传递的重要步骤。β-连环素是一种多功能胞浆蛋白，多发性结肠腺癌有不同的蛋白结合功能域。在Wnt信号通路中，β-连环素与轴蛋白(axin)、腺瘤性结肠息肉(adenomatous polyposis coli，APC)和糖源合酶激酶-3 β(GSK-3β)相互作用，形成复合物。无Wnt信号时，丝/苏氨酸激酶的GSK-3β和酪蛋白激酶Ⅰ(casein kinase Ⅰ，CKⅠ)对β-连环素氨基端双磷酸化，进而启动泛素系统降解β-连环素。而在有Wnt信号时，信号传到细胞内，激活胞浆内的散乱蛋白(dishevelled protein，Dsh)，抑制GSK-3β的活性，β-连环素不能降解，而在胞内大量积累并进入核内，与DNA结合蛋白TCF(T cell factor)/LEF(lymphoid enhancer factor)的结合，启动靶基因(如c-myc、c-jun、cyclin D1[1]等)的表达。研究结果表明：多种实体肿瘤的发生发展过程中常有异常的Wnt信号通路激活，而β-连环素的异常定位在实体肿瘤的发生中起重要的、直接的作用。在多种实体肿瘤中如结肠癌、前列腺癌、卵巢癌、黑色素瘤、肝细胞癌中均可见到β-连环素在胞核的异常定位。业已证实实体肿瘤中β-连环素在胞核的异常定位与实体肿瘤细胞的增殖、黏附等生物学活性相关[3]。由于在造血细胞上缺少典型的黏着连接(adherens junction)，β-连环素在血液肿瘤的表达及定位并没有得到较多的研究，但已经证实，Wnt信号通路确实参与到造血细胞的发育和增殖过程[6]。由此可以推测，血液肿瘤细胞中可能存在Wnt信号通路的异常活化，可能有β-连环素的异常定位。本研究选择了4种常见的血液肿瘤细胞株进行研究，发现β-连环素在Daudi、K562细胞中表达在胞膜及胞浆，但在胞核并没有观察到β-连环素的表达，而Jurkat、Thp-1细胞中可观察到β-连环素在胞核的表达。可以推断在Jurkat、Thp-1细胞株中，β-连环素在胞核异常表达，进而引起其下游一系列影响细胞周期的靶基因的过度表达可能在Jurkat、Thp-1细胞株 的发生发展中起一定的作用。在部分血液肿瘤中存在有Wnt信号通路的异常活化，β-连环素在胞浆内降解/积累调节失控、异常位引起下游靶基因的转录是部分血液肿瘤发生的原因之一。研究已证实，在实体肿瘤中引起β-连环素异常表达的因素包括：①β-连环素本身表达水平的增高[7];②通过抑制β-连环素降解，进而上调β-连环素的途径，包括APC蛋白、β-连环素、GSK-3β的突变。APC基因是一种典型的肿瘤抑制基因，与结肠癌发生的关系极为密切。在大多数结肠直肠癌中均发现APC基因突变，它的突变导致APC蛋白“去顶”改变，使其丧失与β-连环素、轴蛋白相互作用的功能，APC蛋白的失活可直接导致β-连环素在核内的积累[8]。在黑色素瘤、无APC基因突变的结肠癌和其它类型的肿瘤，如肝细胞癌、卵巢癌、子宫内膜癌、前列腺癌等[9]肿瘤细胞中可检测到β-连环素(CTNNB1)基因的突变(主要发生在第3外显子)其氨基端的Ser/Thr磷酸化位点突变可影响其降解过程，造成β-连环素胞内水平升高。本研究进一步采用实时定量RT-PCR方法定量检测4种细胞株中β-连环素基因表达水平，研究Jurkat、Thp-1细胞株存在β-连环素异常定位的原因是否包括β-连环素基因表达水平的增高。研究发现，Jurkat、Thp-1细胞株的β-连环素基因表达水平并不比K562、Daudi高，而是比K562、Daudi的表达量更低。这提示Jurkat、Thp-1细胞株存在β-连环素的异常定位的原因并不是发生于β-连环素基因转录水平。可能会类似实体肿瘤，有β-连环素本身或者Wnt 通路其它组分的突变，或其它原因引起的β-连环素在胞浆内降解/积累调节失控。具体引起Jurkat、Thp-1细胞株中β-连环素在胞核异常定位的原因仍需要进一步的研究。

　　【参考文献】

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