血管性血友病因子和胎盘生长因子检测在AMI中的临床意义
发表时间：2011-08-10 浏览次数：437次
作者：桑圣刚,荣红,覃西,钱士匀 作者单位：海南医学院 热带医学与检验学院;附属医院，海南 海口
【摘要】目的：观察急性心肌梗死(Acute Myocardial Infarction,AMI)患者循环内皮细胞(CEC)核DNA改变的特点，检测血浆中血管性血友病因子(Von Willebrand factor, vWF)、胎盘生长因子(Placental growth factor,PLGF)的含量变化，探讨其临床意义。方法：应用单细胞凝胶电泳技术(SCGE)检测102例AMI患者(AMI组)和75例健康人(对照组)CEC核 DNA的损伤;以酶联免疫吸附实验法(ELISA)进一步检测两组vWF、PLGF的含量。结果：SCGE显示:AMI组患者(93.72±6.75)% CEC核 DNA电泳呈明显的“彗星”状，其彗尾DNA含量为(42.22±1.56)%;对照组(10.24±4.33)%CEC核DNA表现为“彗星”状，其彗尾DNA含量为(6.31±2.41)%。AMI组与对照组彗星率、彗尾DNA含量比较差异均有显著性意义(P均<0.001)。AMI组vWF、PLGF的含量显著高于对照组(P<0.01)。结论：AMI组患者血管内皮细胞明显损伤;血浆中vWF、PLGF的含量明显升高，早期检测血浆vWF、PLGF的含量可能有利于AMI的治疗，甚至可以起到预防作用。
【关键词】 心肌梗死,循环内皮细胞,血管性血友病因子,胎盘生长因子,损伤
[ABSTRACT] Objective: To observe the alteration of nuclear DNA of circulating endothelial cells, and changes of plasma Von Willebrand factor (vWF) and placental growth factor (PLGF) concentrations in patients with acute myocardial infarction in order to explore its clinical significance. Methods: The damage of nuclear DNA in circulating endothelial cells was assayed by single cell gel electrophoresis (SCGE); concentrations of vWF and PLGF were detected by ELISA in 102 patients with acute myocardial infarction (AMI group) and 75 healthy people (control group). Results: In the AMI group, (93.72%±6.75) % nuclear DNA in circulating endothelial cells were shown as comet and the DNA content in the tail was (42.22%±1.56) %, significant higher than (10.24±4.33)% and (6.31±2.41) % ( both P<0.05) of the control group. The concentrations of vWF and PLGF were also both significantly higher than that of the control group (P<0.01). Conclusions: In patients with AMI, the vascular endothelial cells are significantly damaged; the contents of vWF and PLGF were significantly increased, thus early detection of plasma vWF and PLGF levels may contribute to the treatment and prevention of AMI.
[KEY WORDS] Acute myocardial infarction; Circulating endothelial cell; Von Willebrand factor; Placental growth factor; Damage
急性心肌梗死(AMI)是严重危害人类健康的疾病，其病理、生理基础是不稳定冠状血管粥样硬化斑块在某些诱因的作用下首先引起内皮细胞损伤，随着人民生活水平的提高和人口老龄化，AMI的发病率呈上升趋势，对人类的健康及生命已构成严重威胁。大量实验证明血管内皮细胞(vascular endothelial cell,VEC)损伤是心血管疾病发生的始动因素[1]，从VEC着手探讨心血管疾病的原因、预防及其治疗愈来愈多的受到了国内、外学者的关注。本文从AMI患者外周提取循环内皮细胞(CEC)进行研究，探讨CEC核DNA的改变情况，同时检测AMI患者血浆中血管性血友病因子(vWF)、胎盘生长因子(PLGF)的含量，探讨AMI患者VEC损伤的原因，为AMI的治疗、预防提供新的理论依据。
1 材料与方法
1.1 病例选择
选取2007年9月～2010年3月海南医学院附属医院和海南省人民医院心内科确诊的AMI患者102例，其中男性59例，女性43例，平均年龄(52.6±4.5)岁，全部符合临床诊断标准[2]。同期选择海南医学院附属医院绿卡中心健康体检者75例为对照组，其中男性47例，女性28例，平均年龄(50.4±5.3)岁。AMI组和对照组均无呼吸系统疾病、肝病、脑血管疾病、高血压、高脂血症、肾病、糖尿病及其他自身免疫性疾病。
1.2 仪器、试剂
1.2.1 仪器
电泳仪(北京市六一仪器厂DYY7B型)，荧光显微镜 (日本 尼康E800)，低温冰箱(青岛海尔)，离心机(安徽科大创新有限公司中佳分公司KDC1042)，凝胶成像系统(德国 Herolab UVT28)，彗星图像分析系统(捷克LUCIATMCOMET)，酶标仪(美国宝特ELX800)。
1.2.2 试剂
Percoll分离液(美国Ameisco公司)，兔抗人Ⅷ因子相关抗原、FITC标记的羊抗兔IgG荧光抗体(美国ADI公司)，正常熔点琼脂糖、低熔点琼脂糖、月桂酰基肌氨酸钠、TritonX100、ThrisHCl(美国Ameisco公司)，Na2EDTA、二甲基亚砜、溴化乙锭、胎盼蓝(西安华美公司)，vWF(上海太阳生物科技有限公司)，PLGF ELISA试剂盒(美国R&D公司)。
1.3 方法
用含0.109 mol/L的枸橼酸钠的负压管采集AMI患者发病24h内和正常对照组空腹血液各10mL，立即颠倒混匀，分离血浆和CEC备用。
1.3.1 CEC提取鉴定
取新鲜枸橼酸钠抗凝血10mL用 percoll密度离心法分离CEC;以Ⅷ因子相关抗原鉴定所提细胞为CEC;用RPMI1640调细胞浓度为1×106·L1，在光镜下用台盼蓝法检测活细胞率在95%以上，细胞悬液备用。
1.3.2 单细胞凝胶电泳[3]
45℃下将150μL 10g/L 的正常熔点琼脂糖涂在磨砂载玻片上, 加盖玻片轻压，于4℃凝固10min制成第一层胶;37℃下将150μL含1000个细胞的悬液与等体积5g/L低熔点琼脂糖混合均匀，取150μL滴在第一层胶上，加盖玻片轻压，于4℃凝固10min制成第二层胶;37℃下取5g/L低熔点琼脂糖100μL涂在第二层胶上并加盖玻片轻压，于4℃凝固10min制成第三层胶。小心去掉盖玻片，将包埋了细胞的载玻片小心放入细胞裂解液中，置于4℃ 1.5h。取出载玻片，紧密排列于水平电泳槽中，加入电泳缓冲液，4℃解旋20min。在电压32V，电流 300mA，4℃电泳25min。电泳后小心将载玻片浸于中和液 15min两次。以20μg/ mL 溴乙锭染色20min，加盖玻片。在荧光显微镜下进行观察、照相。
1.3.3 图像分析
在荧光显微镜(400倍)下观察，每片计数100个细胞，用彗星图像分析系统进行分析细胞彗星率和彗尾DNA百分含量。
1.3.4 vWF、PLGF检测
严格按照试剂盒进行检测。
1.4 统计学处理
所得数据用SPSS11.5分析，数据以均数±标准差(±s)表示，采用student t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 单细胞凝胶电泳结果
荧光显微镜下观察到对照组血液中(10.24±4.33)%的CEC表现为拖尾的荧光图象(图1)，彗尾DNA含量%为(6.31±2.41)%。AMI患者急性期血液中(93.72±6.75)% CEC呈现典型的“彗星” 状图形(图2)，彗尾DNA含量为(42.22±1.56)%。AMI患者急性期血液中CEC的彗星率、彗尾DNA含量均显著高于对照组(P均<0.001)。
2.2 vWF、PLGF结果
3 讨论
AMI的病理过程涉及损伤、炎症、渗出、变性和血栓形成，其中VEC的损伤可能是其发生的重要机制之一。CEC是VEC脱落至循环血液中的内皮细胞，正常人每毫升外周血中CEC含量不超过3个，VEC损伤时CEC升高，其数量波动于0～1500个/mL[4] 。国外研究表明，CEC的数量变化反映了VEC的损伤程度，其数量增加与病变活动度呈正相关，在评估血管性疾病方面具有重要意义。本文应用单细胞凝胶电泳技术检测外周血CEC核DNA损伤，在电场力的作用下，受损CEC核中带阴电荷的DNA断片在凝胶分子筛中向阳极移动，形成“彗星”状图像，含DNA链缺口越多，进入尾部的DNA越多，表现为尾长增加，未损伤细胞在电泳中DNA仍停留于核中形成圆形荧光团。计数细胞彗星率和彗尾的荧光强度可以定量反映群体细胞中DNA链断裂损伤程度[5,6]。电泳结果发现AMI急性期患者(93.72±6.75)%CEC核DNA有明显损伤，呈典型“彗星”状，其彗尾DNA含量明显升高，高达(42.22±1.56)%，显著高于对照组，表明AMI急性期患者CEC的出现不仅仅是VEC简单的数目变化，而是有VEC核DNA损伤的结果，这与Jugdutt[7]的观点相一致。
vWF是血管内皮细胞损伤的高特异性分子标志物，血浆中vWF水平升高是动脉内皮损伤和功能不良的标志[8]。研究发现AMI患者血中vWF值明显高于对照组，表明AMI患者血管内皮细胞功能失调，VEC损伤。由于血管内皮细胞的损伤，血管活性物质的分泌与释放失衡，导致冠状血管痉挛，冠状血管内粥样斑块破裂，同时降低了内皮细胞的抗血栓能力，增加血液的凝固性，导致血栓形成，促进AMI的发生和发展。近期研究结果显示[9]，与血浆vWF 水平小于900 IU/ L 的患者比，大于1 260 IU/ L的患者患冠心病的风险为1.2 ( 95 %CI为1.08～1.9)。进一步证明了VEC在AMI的发生、发展中起着极其重要的作用，VEC的损伤可能是AMI发生的先决条件。
PlGF是血管内皮生长因子家族成员之一，临床研究表明，PlGF在AMI后左室功能恢复方面发挥重要的作用。Iwama等[10]分别在AMI后的1，3，7d采集外周静脉血测定PlGF水平发现AMI患者心肌梗死后的24h内PlGF水平明显上升，并且在第3天达到高峰，持续升2两周后开始逐渐下降。本研究显示，AMI患者PlGF水平在24h即急剧升高，表明PLGF含量的变化与AMI的发生有密切的关系。Heeschen等[11]对经血管造影证实急性冠脉综合征(ACS)547例患者，进行血清PIGF以及心肌坏死标志物、血小板激活标志物和炎症标志物水平测定，结果发现在ACS患者中，PIGF水平升高(大于27.0ng/L )在30d内终末事件发生率显著增加。充分证明PLGF水平是ACS患者急性冠脉事件危险预测指标。
VEC损伤在AMI发生、预防和治疗中的重要性越来越受到国内、外研究人员的重视，研究VEC损伤的机制，有可能在病理、生理基础上揭示AMI发生的原因，为AMI的发生，发展，治疗，甚至预防提供新的理论依据。但CEC的检测程序较为复杂，不利于广泛开展。vWF和PLGF作为VEC损伤的重要标志物，检测非常简便。及时测定AMI患者vWF和PLGF可全面反映和判断血管病变及其严重程度，对于AMI的治疗，判断预后，甚至预防可能有重要意义。
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