过滤后血液制备冰冻红细胞的质量探讨

　　作者：沈莉,李建民,梁晓虎,王丽红,孙晓红　　作者单位：050071 石家庄市，河北省血液中心(沈莉、李建民、梁晓虎、王丽红、孙晓红);河北医科大学第三医院(赵晓霞);河北医科大学(田会)

　　【关键词】 冰冻红细胞

　　目前国内血站系统制备冰冻红细胞制品主要是针对Rh(-)血液，大都使用不经过滤处理浓缩红细胞。文献报道去甘油化的红细胞输注后可减少非溶血性输血发热反应，巨细胞病毒感染和HLA同种免疫反应，但是在去除白细胞上用高质量白细胞过滤器则比冷冻去甘油化更有效[1]。经冷冻和去甘油化后仍有某些有活性淋巴细胞存留。去甘油化后红细胞不宜用γ射线照射以预防GVHD[1]。为提高冰冻红细胞制品质量，笔者尝试对采集后24 h之内Rh(-)血液进行过滤，过滤后的全血在(4±2)℃条件下保存10 d(CPD)后，再进行红细胞甘油化冷冻处理，并在冷冻后1年内完成去甘油化操作。现就13例经过滤处理的Rh(-)冰冻解冻去甘油红细胞的质量检测情况报告如下。

　　[1] 材料与方法

　　1.1 材料 400 ml带过滤器的采血四联袋、批号200605242(山东威高)，57%复方甘油溶液，批号05110302(北京博德桑特)，9%浓度氯化钠溶液，批号060112(北京博德桑特)，羟乙基淀粉40氯化钠注射液，批号A05112214 (山东华鲁制药厂)，0.9%氯化钠溶液，批号060118404(石家庄四药公司)，离心机Jouan KR4L型(r=28.1cm)(法国，捷安公司)，无菌接驳仪TSCD201A型(日本，泰尔茂公司)，多头输液器，批号20050803(山东威高)，爱华HY 2调速多用振荡仪(国产，苏州)，VIS 723型分光光度仪(国产，上海)，Sysmex 820血细胞计数仪(日本，蓝桥公司)，Olympus CHK显微镜(中日合资，台湾)。

　　1.2 制备方法

　　1.2.1 Rh(-)血液的过滤及红细胞的分离：将“采血型滤器联袋”采集的检测合格400 ml Rh(-)全血，在自然重力作用下进行过滤，过滤完成后的全血(含二联袋)置(4±2)℃条件下贮血冰箱中保存;在保存10 d后对红细胞进行离心分离，移除血浆后留下红细胞(红细胞中不加入保存添加剂)备用。

　　1.2.2 过滤后红细胞的甘油化及冰冻处理：将分离后的红细胞血袋与57%复方甘油溶液袋，通过多头输液器并经无菌导管连接使之成为联袋系统;边振荡边向红细胞袋中加入甘油(滴速为100滴/min)，直至320 ml甘油加毕;并在室温下静置平衡40 min;将静置后血袋以2 477 r/min，(4±2)℃，离心6 min ;离心毕分离出上清多余甘油后，红细胞血袋置-80℃速冻冰箱内冻存。

　　1.2.3 冷冻后红细胞的解冻处理：将冷冻后红细胞置37℃恒温水浴箱中进行解冻，可左右轻轻晃动呈垂直位血袋以加速融化过程，避免血袋上导管浸入水中，直至完全融化。

　　1.2.4 解冻后红细胞的去甘油化洗涤处理：将融化后红细胞按文献[2]的改良方法进行洗涤处理。

　　1.3 冰冻解冻去甘油红细胞质量检测

　　1.3.1 上清游离血红蛋白：参照文献[3]方法进行测定。全血离心，取上层血清0.02 ml和Hb标准应用液0.02 ml，依次加入2%邻 甲苯胺溶液及1%H202溶液各1.0 ml。放置10 min，分别加入2%乙酸溶液10 ml混合，用435 nm进行比色，计算得出游离血红蛋白含量(mg/L)。

　　1.3.2 红细胞回收率=[成品Hb含量/(总上清Hb含量+成品Hb含量)]×100%

　　1.3.3 红细胞体外溶血试验=[(37℃水浴后上清Hb含量-37℃水浴前上清Hb含量)/37℃水浴后上清Hb含量]×100%

　　1.3.4 红细胞中残留甘油量的检测：参照文献[4]方法，采用过碘酸钠法测定残留甘油量。用三氯醋酸将成品红细胞溶血，离心，取上清液稀释60倍，用过碘酸钠氧化成甲醛，在铵离子(醋酸铵)存在时缩合成黄色的3,5 二乙酰 1,4 二氢二甲基吡啶，415 nm比色，黄色深浅和甘油三酯浓度呈正比。

　　1.3.5 红细胞中酸性磷酸酶含量检测：对冻融后及洗涤后红细胞标本进行离心取上清，按文献[5]提供的磷酸苯二钠法，充分混合后用520 nm波长比色，读取吸光度，查标准曲线求值。

　　1.3.6 红细胞中组胺含量检测：按[参考文献][6]提供的方法，对冻融后及洗涤后红细胞标本，用光度仪测定组织胺浓度。测定条件为：600 V电压，激发光及发射光波长分别为360、450 nm，狭缝分别为20、5 nm;并按下例公式计算组织胺释放百分率并求值。组织胺释放百分率=变应原管 对照管/总细胞管 试剂空白管。

　　1.3.7 血小板、白细胞计数：血小板用血细胞计数仪进行检测;白细胞计数用Nageotte计数板镜下检测。

　　1.4 统计学分析 计量资料以±s表示，组间比较采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

　　[2] 结果

　　为便于说明问题，笔者将常规(红细胞未过滤处理)制备(二者方法一致)的冰冻解冻去甘油红细胞13例作为对照组并进行比较。

　　[3] 讨论

　　Rh(D)阴性血型在我国汉族人群中所占比例为3‰～5‰[7]，属于较稀有的血型。因此，建立Rh(D)阴性血型库，将平时筛查出来的Rh(D)阴性血液经加甘油深低温冷冻保存处理，可作为贮存Rh(D)阴性血液的一种方法，在临床急需时且又不易找到合适献血者的情况下，不失为作为急救或缓解困难的有效措施。文献报道冰冻前去甘油可使洗涤程序简化，缩短冻成和解冻时间，且为临床急症患者多争取抢救时间，既节约成本又减少分装血液可能导致的污染机会[8]。本文冷冻前去甘油的意义与文献报道一致。

　　随着血站系统逐渐开展血液滤除白细胞的业务，用“采血型滤器”完成血液过滤已成为现实并呈扩大趋势。在实际的工作中，血液在24h内就完成过滤，而Rh(D)阴性血液的筛查结果，往往是在血液完成过滤后才知晓，这就提出了一个新问题，既过滤后的Rh(D)阴性血液是否可以用于制备冰冻红细胞。AuBuchon等[9]研究的保存前滤除血液中白细胞的过滤器系统LeukonetTM 后发现，滤除白细胞的红细胞悬液经4℃、42 d保存后红细胞的溶血率、ATP、2，3 DPG水平和红细胞24 h体内回收率均与未过滤血液无明显差异。Rapaille等[10]对一种在线全血过滤装置研究表明，全血滤除白细胞后保存的红细胞和血浆，其性质与对照组比较均差异无统计学意义。这就表明过滤对红细胞不会造成严重损害。从表1、2可见，无论红细胞过滤与否，其制备的冰冻解冻去甘油红细胞制品质量均能符合国家标准要求[11]，在红细胞回收率、体外溶血试验、游离血红蛋白含量及残留甘油量上二者并无明显差别，但在残余血小板、残余白细胞上后者优于前者，且有明显差别。从表3可见，血液过滤与否，冻融及冻融洗涤后的红细胞中酸性磷酸酶含量上二者有一定差别，而无论血液过滤与否，冻融及冻融洗涤后的红细胞中组胺含量上二者并无差别。保存期内白细胞和血小板代谢物(酸性磷酸酶和组胺)释放比较，过滤者明显优于未过滤者。本实验结果在酸性磷酸酶含量上与文献报道的一致。红细胞中组胺含量差异的原因则可能与冷冻和冷藏不同保存有关。可见，过滤后血液用于制备冰冻红细胞，不会导致其质量下降，且可进一步提高其质量。笔者认为，血液过滤尽管会对红细胞膜造成一定的损伤，但在滤器滤膜性能较好的情况下，这种损伤几乎不影响红细胞膜的完整性，同时过滤完成后血液在(4±2)℃条件下贮存至10 d，既减少了白细胞崩解又有助于红细胞膜自行修复。在对过滤后红细胞进行冷冻处理之前，观察红细胞是否出现溶血现象也是一个不容忽视的问题。

　　综上所述，过滤后的Rh(D)阴性血液可用于制备冰冻解冻去甘油红细胞制品，但就如何保证和提高其质量有待进一步实验论证。

　　【参考文献】

　　[1] 耿敬磊，史丽平，沈莉，等.冰冻Rh(D)阴性细胞胞去甘油化洗涤方法的改良.河北医药，2006，28：395.

　　[2] 李援邻，李裕华，王春荣，等.可提高冷冻去甘油红细胞制品回收率的改良工艺.中国输血杂志，2006，19：394.

　　[3] 叶应妩，王毓三主编.全国临床检验操作规程.第1版.南京:东南大学出版社，1997.61 62.

　　[4] 赵阳，黎世杰，陈扬凯.改进洗血仪程序用于制备冰冻红细胞.中国输血杂志，2005，18：214.

　　[5] 李影林主编.中华医学检验全书(上卷).第1版.北京：人民卫生出版社，1996.833.

　　[6] 李影林主编.中华医学检验全书(下卷).第1版.北京：人民卫生出版社，1996.2280.

　　[7] 于琦.Rh阴性血液冷冻血库的建立及意义.中国输血杂志，2001，1：30.

　　[8] 王赤林，袁继荣，李双.冰冻红细胞制备过程中若干问题探讨.中国输血杂志，2004，17：21.

　　[9] AuBuchon JP, Elfath MD,Popovsky P, et al. Evaluation of a new peratorage leukoreduction filter for red blood cell units. Vox Sang,1997，73:101.

　　[10] Rapaille A,Moore G,Siquet J,et al.Perstorage leukocyte reduction with in line filtration of whole blood:evaluation of red cell and plasma storage. Vox sang,1997，73:28.

　　[11] 中华人民共和国卫生部.中国输血技术操作规程血站部分.天津：天津科学技术出版社，1997.42 433.