同一供者外周血单个核细胞输注治疗单倍相合骨髓移植后白血病复

　　作者：薛梅,王恒湘,段连宁,刘静,阎洪敏,朱玲　　作者单位：空军总医院血液科, 北京 100036

　　【摘要】本研究探讨同一供者外周血单个核细胞输注(DMNCI)治疗单倍相合骨髓移植后白血病复发的疗效和安全性。3例单倍相合骨髓移植后白血病复发患者接受GCSF动员的DMNCI治疗，其中例1和例2骨髓移植前分别为ph+急性淋巴细胞性白血病伴中枢神经系统侵犯部分缓解及慢性粒细胞性白血病急性变部分缓解，在骨髓移植后这两例均血液学复发，各接受单次DMNCI，单个核细胞剂量分别为8.25×108/kg和5.24×108/kg;CD3+细胞剂量分别为1.87×108/kg和1.14×108/kg。第3例骨髓移植前为CML急性变，治疗后并达缓解。移植后分子水平复发,接受逐渐提高单次细胞数量的分次输注，首次DMNCI剂量为2.0×107/kg，CD3+细胞剂量为1.1×107/kg。同时观察3例患者输注后白血病缓解情况及并发症。结果显示，3例患者均出现不同疗效，2例血液学复发患者骨髓均暂时缓解，但分别于DMNCI后41、48天死于严重移植物抗宿主病(GVHD)、复发及衰竭。分子水平复发患者分次接受DMNCI，输注2次后达分子水平缓解，STRPCR测定证实为供者基因型。3例均发生急性GVHD，2例接受单次剂量输注者发生Ⅳ度以上GVHD，1例接受分次输注患者发生Ⅰ度GVHD。3例均未发生明显骨髓抑制，分子水平缓解者随访半年无病生存。结论: DMNCI可能具有抗白血病作用，可用于单倍相合骨髓移植后白血病复发的治疗，对分子水平复发者的疗效较对血液学复发者好;输注MNC为×108/kg后GVHD严重。DMNCI起始剂量×107/kg并逐渐提高单次剂量的分次输注方法更为安全。

　　【关键词】 白血病

　　Abstract This study was aimed to investigate the therapeutic effect of growth factorprimed donor peripheral mononuclear stem cell infusion (DMNCI) for patients with relapsed leukemia after haploidentical bone marrow transplantation (BMT). The donor was the same individual for both BMT and DMNCI. All the three patients described here were Philadelphia chromosome positive leukemia before haploidentical BMT; one case was newly diagnosed as acute lymhoblastic leukemia (ALL) and the others were chronic myeloid leukemia (CML). Two cases (one with ALL and one with CML) manifested with clinical relapse and the third case was in the stage of molecular relapse. The former 2 patients received a single bulk dose of DMNCI, the inoculums of which contained mononuclear cells of 8.25×108/kg or 5.24×108/kg and CD3positive cells of 1.87×108/kg or 1.14×108/kg respectively. The third case received initial dose of DMNCI which was 2.0×107/kg, and received CD3 positive cells of 1.1×107/kg. The results indicated that the different therapeutic responses were found in all three patients. Two patients with clinical relapse received temporal remission, and died of severe graft versus host disease (GVHD), relapse and failure at day 41 and 49 after DMNCI. The third patient with molecular relapse received molecular remission after 2 infusions of DMNCI. All three patients developed acute GVHD, but two patients among them developed GVHD of grad Ⅳ, other one developed GVHD of grad Ⅰ and has survived in diseasefree state during half a year followup. It is concluded that the DMNCI may be effective for the treatment of relapsed leukemia after haploidentical BMT and this treatment can be safe if the initial dose of DMNCI is 107/kg and subsequnt single dose of DMNCI gradually increases.

　　随着对GVHD和移植物抗白血病效应研究不断深入，异基因骨髓移植后白血病复发患者采用供者淋巴细胞输注(DLI)治疗的效果已得到肯定，但因引起严重GVHD和感染等并发症，近年来国外报道应用重组人粒细胞集落刺激因子(rhGCSF)动员的同一供者外周血单个核细胞输注(DMNCI)，以代替淋巴细胞输注治疗移植后白血病复发患者，结果发现DMNCI引起的并发症轻且抗白血病效应强。关于DMNCI用于治疗单倍相合骨髓移植后白血病复发患者疗效如何，国内外文献报道极少，我院2003-2005年采用此方法治疗3例单倍相合骨髓移植白血病复发患者，现将结果报告如下。

　　临床资料

　　3例均为2003年9月-2005年7月在我院住院的患者，都接受单倍相合异基因骨髓移植，急性GVHD预防方法是联合免疫抑制环孢素A、抗人胸腺细胞球蛋白、甲氨喋呤、霉酚酸酯、巴利昔单克隆抗体(CsA、ATG、MTX、MMF、抗CD25单克隆抗体)和供者应用GCSF动员[1]。STRPCR分析用于判断供受者嵌合状态。3例患者单倍相合骨髓移植前临床特征及予处理方案见附表。

　　单倍相合骨髓移植后白血病复发情况

　　例1于骨髓移植后28天血象：血红蛋白80 g/L，白细胞2.6×109/L，血小板7.9×1010/L;骨髓象为完全缓解状态,HLA鉴定为供者型。移植后40天出现轻度皮肤GVHD，65天出现右侧面瘫。血象：血红蛋白115 g/L，白细胞1.0×1010/L，血小板6.9×1010/L;骨髓象：有核细胞增生明显活跃，原始幼稚淋巴细胞56%。诊断ALL骨髓移植后血液学复发。例2于移植后40天血象：血红蛋白70 g/L，白细胞3.1×1010/L，血小板3.6×1010/L;骨髓象：有核细胞增生活跃，原始粒细胞14%。HLA鉴定为嵌合型,诊断CML骨髓移植后血液学复发。例3于移植后30天血象：血红蛋白80 g/L，白细胞8×108/L ，血小板8.2×1010/L;骨髓象为完全缓解状态,Ph染色体阴性，bcr/abl融合基因阴性，HLA为完全性嵌合(供者型)，移植后92天血象：血红蛋白90 g/L，白细胞7×1010/L，血小板2.5×1010/L;骨髓象大致正常，未见幼稚细胞。Ph染色体阴性，bcr/abl融合基因由阴性转为阳性，HLA由完全性嵌合转为混合性嵌合，诊断：CML骨髓移植后分子水平复发。

　　DMNCI前预处理情况

　　3例患者均予减停免疫抑制剂如骁悉、CsA，同时加用格列卫治疗，400-600 mg，每日1次，口服。为减轻外周血单个核细胞输注前肿瘤负荷，2例血液学复发患者先予化疗治疗，例1于移植后68天接受氟达拉宾/阿糖胞苷/西艾克/强地松方案化疗，化疗后骨髓中原始幼稚细胞56%。移植后78天输注同供者外周血单个核细胞。例2接受去甲氧柔红霉素/阿糖胞苷方案化疗，化疗结束1周外周血原始粒细胞80%，移植后50天输注同供者外周血单个核细胞。例3予减停免疫抑制剂及口服格列卫治疗2月，bcr/abl融合基因未转阴，于移植后160天、202天输注同供者外周血单个核细胞。

　　供者外周血单个核细胞输注

　　采集供者外周血单个核细胞前，先予供者细胞动员，此供者与骨髓移植的供髓者系同一人。重组人粒细胞集落刺激因子(rhGCSF)5 μg/(kg•d)，皮下注射连续3天。经CS3000血细胞分离机分离外周血单个核细胞(MNC)，提取8-10 L血液中的MNC约55-60 ml，并计数输注的淋巴细胞总数，流式细胞仪检测淋巴细胞亚群。例1、例2采用单次DMNCI,例1输注的MNC为8.25×108/kg、CD3+为5.24×108/kg。例2输注MNC为1.87×108/kg，CD3+为1.14×108/kg。例3采用分次逐渐提高细胞剂量DMNCI,首次MNC剂量为2.0×107/kg，CD3+为1.1×107/kg， 6周后第二次输注，MNC细胞剂量为5.0×107/kg，CD3+为2.4×107/kg。3例患者DMNCI均在15分内迅速输毕。输注前未使用免疫抑制剂预防GVHD。

　　疗效评价

　　定期检查血象、骨髓象、bcr/abl融合基因、染色体及HLA检测等。

　　结 果

　　例1接受DMNCI后第5天发生高热、皮疹、呕吐、腹泻，第10天出现Ⅲ度以上肠道GVHD，腹泻次数最多达20次，血性便，腹泻量1 000 ml以上，先后给予抗CD25单克隆抗体、OKT3、CsA、甲基强的松龙等治疗，效果不理想。第15天血象：血红蛋白79 g/L，白细胞3.3×109/L，血小板4.0×1010/L;骨髓象示幼稚淋巴细胞为5%。第21天出现重度肝脏GVHD，总胆红素274 mmol/L,直接胆红素212 mmol/L，GPT 500 U/L，GOT 116 U/L。第30天骨髓象：有核细胞增生活跃，幼稚淋巴细胞0.5%。Ph染色体(-)，bcr/abl融合基因(-)，DMNCI后未发生明显骨髓抑制，GVHD未完全控制，于DMNCI第41天死于髓外复发、全身衰竭。

　　例2接受DMNCI第4天开始高烧、腹泻，伴出血性膀胱炎。第8天血象：血红蛋白50 g/L，白细胞1.0×108/L，血小板5.0×109/L;骨髓象：有核细胞增生减低，粒系74%，未见原始粒细胞、早幼粒细胞，红系10%，淋巴16%，巨核细胞1个。第10天出现Ⅳ度肠道GVHD，腹泻次数最多达23次，血性便，腹泻量2 000 ml以上，先后给予舒莱(抗CD25单克隆抗体)、FK506、ATG、甲基强地松龙等治疗，GVHD逐渐减轻。第15天血象：血红蛋白104 g/L，白细胞1.6×109/L ，血小板2.4×1010/L;骨髓象：有核细胞增生活跃，粒∶红比为5∶1，未见原始粒细胞、早幼粒细胞。第35天出现肝脏严重GVHD，总胆红素114 mmol/L，直接胆红素89.7 mmol/L。DLI输注后第40天血象：血红蛋白92 g/L，白细胞3.2×1010/L，血小板1.5×1010/L，血片分类原始粒细胞49%;骨髓中原始粒细胞47%，于DMNCI后第48天患者死于多器官衰竭。

　　例3接受DMNCI第14天发生Ⅰ度皮肤及肠道GVHD，未特殊处理，2周后自愈。血象：血红蛋白70 g/L，白细胞2.2×109/L，血小板1.1×1011/L;骨髓象：有核细胞增生活跃，粒∶红比为2.5∶1，各阶段细胞比例、形态大致正常。用实时定量PCR方法定期检测bcr/abl融合基因拷贝数百分率，结果显示，虽百分率逐渐降低，但bcr/abl融合基因持续阳性。6周后予第2次DMNCI，14天后出现Ⅰ度皮肤GVHD，转氨酶升至236 U/L，血胆红素正常。给予甲基强地松龙40 mg，1次/日，静脉滴注，皮肤GVHD控制，肝功逐渐正常。30天后血象：血红蛋白86 g/L，白细胞1.7×109/L，血小板1.28×1011/L，骨髓象大致正常，实时定量PCR检测bcr/abl融合基因转为阴性，STRPCR测定为供者基因型，HLA转为为完全性嵌合，患者至今已无病生存6个月。3例患者接受DMNCI后均未发生明显骨髓抑制。

　　讨 论

　　尽管骨髓移植使白血病治愈率大大提高,但仍有部分患者最终复发,复发成为影响患者长期存活的一大障碍,既往采用常规化疗，患者很难再次缓解，也不易耐受二次移植，且复发率更高，故大多数情况是放弃治疗。1989年Komori等[2]首次报道1例ALL患者在alloHSCT后白血病复发，采用DLI治疗成功，此后许多学者研究DLI治疗骨髓移植后白血病复发的有效性，并肯定其介导移植物抗白血病(GVL)的疗效，移植后白血病复发已成为DLI输注的金标准。为减少肿瘤负荷，可先行化疗，以提高DLI疗效。

　　文献报道，DLI输注对CML的疗效较好，对AML、MM次之，对ALL最差[4];CML不同阶段对DLI缓解率也不相同。CML细胞遗传学及分子学复发者缓解率90%-100%，是DLI治疗的最佳适应证。CML慢性期、加速期及急变期骨髓移植后血液学复发缓解率分别75%、10%-36%。关于输注的细胞数量及次数问题，Dazzi等[6]认为输注<(1.0-2.0)×106/kg的T细胞能很好防止GVHD发生，而抗白血病作用并不减低。Cesare等[7]回顾分析51个中心接受逐渐递增细胞数量的分次DLI治疗的298例患者，按首次接受MNC数不同将患者分3组，A组细胞数<2.0×107/kg，B组细胞数<(2.0-20)×107/kg，C组细胞数>2.0×107/kg。结果3组治疗反应率接近，A组的生存率、无病生存率最高，骨髓抑制和GVHD发生率最低，相关死亡率也较低。故认为初始剂量非常重要，小于<(2.0-20)×107/kg是合适细胞剂量，否则并发症及死亡率明显增高。

　　近年来，国外报道应用重组人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)动员GPBSCI代替淋巴细胞输注治疗移植后白血病复发患者，结果并发症减少且抗白血病效应增强[8]。刘代红等[9]报道异基因造血干细胞移植后用GPBSCI预防高危白血病复发的效果。12例均为同胞配型全相合患者，其中9例接受1次输注，2例接受2次输注，1例接受3次输注。仅1例发生较重GVHD，无1例发生全血细胞减少，12例患者中10例无病存活，2例死于复发。

　　以上关于DLI或DMNCI的疗效研究，主要在HLA配型全相合骨髓移植患者中进行。对于单倍相合骨髓移植复发白血病患者是否适合DLI 或DMNCI治疗,认识尚不统一，既往多不主张输注。Collins等[10]认为，输注等同于HLA相合的细胞数量可引起严重GVHD，但Lewalle等[11]对11例单倍相合骨髓移植患者输注不同细胞剂量供者淋巴细胞的观察结果提示，单倍相合骨髓移植后低剂量输注DLI安全可行。他们的观察包括预防性输注和治疗性输注。预防性输注：输注CD3+细胞为3×104/kg的患者，诱导出急性、慢性GVHD，病情无复发;输注CD3+细胞为1×104/kg的患者，且每月1次，共3次，仅发生1度GVHD;前后3次输注的CD3+细胞分别为(1、3、10)×104/kg的患者，均发生GVHD。复发患者接受治疗性输注：CD3+细胞起始数为1×105/kg，以后细胞剂量逐渐增加，每2周输注1次，未发生严重GVHD。

　　单倍相合骨髓移植后复发白血病患者接受DMNCI治疗,目前国内外未见文献报告。本研究报道3例单倍相合骨髓移植白血病患者，2例血液学复发者接受1次性DMNCI输注，输注前采用化疗以减少肿瘤负荷。输注的MNC分别为8.25×108/kg、1.87×108/kg，CD3+细胞分别为1.14×108/kg、6.4×107/kg，输注后骨髓幼稚细胞明显减少。例1于DMNCI输注第30天骨髓原始细胞0.5%，例2于DMNCI输注后一度骨髓原始细胞消失。这2例血液学复发患者对DMNCI均有疗效，但发生严重GVHD，再次予免疫抑制剂治疗，2例均死于疾病复发、GVHD、衰竭。而另1例分子水平复发患者采用分次从低剂量开始增加细胞剂量的方法，两次MNC数、CD3+细胞数分别为2×107/kg和1.1×107/kg以及5×107/kg和2.4×107/kg，仅出现轻度皮肤GVHD，激素治疗有效，bcr/abl融合基因再次转阴性，HLA鉴定由嵌合型转为供者型，已无病生存8个月。

　　我们的结果提示，DMNCI可能具有抗白血病作用，可用于单倍相合骨髓移植后白血病复发患者的治疗，但细胞剂量要适当减少。单次输注MNC为×108/kg，其GVHD严重，起始剂量×107/kg，且分次逐渐提高单次剂量的方法更安全;分子水平复发者较血液学复发者疗效更好。这与复发阶段早、肿瘤负荷少有关。由于本研究例数少，关于DMNCI的疗效有待今后继续深入研究。

　　【参考文献】

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　　11Lewalle A, Triffet A, Delforge A, et al. Donor leukocyte infusions in adult haploidentical transplant: a dose finding study. Bone Marrow Transplant, 2003; 31: 39-44