NK系白血病免疫表型特征

　　作者：麻柔,许勇钢,杨晓红,胡晓梅,李柳,唐旭　　作者单位：中国中医研究院西苑医院血液科，北京 100091

　　【摘要】本研究目的是探讨NK细胞系白血病的的免疫表型。应用流式细胞术检测了297例急性白血病，并就发现的6例NK细胞系白血病病例分析其免疫表型特点。结果表明： 297例急性白血病中CD56阳性43例，占14.5%，CD56阳性率21.4%-98.8%。43例中6例为 NK细胞系白血病，其余37均为急性髓系白血病伴CD56表达;6例NK细胞系白血病中1例急性前髓系/NK细胞白血病(myeloid/NK cell precursor acute leukemia);1例伴有早幼粒细胞样形态的急性髓系/NK 细胞白血病;2例原始NK细胞白血病(blastic NK cell leukemia)，1例NK样T细胞淋巴瘤/白血病(NK-like T-cell lymphoma/leukemia);1例大颗粒淋巴细胞白血病。结论：伴CD56阳性急性白血病，绝大部分是急性髓系白血病伴CD56表达。NK细胞系白血病免疫表型各异，表现从多能造血干细胞经历髓系抗原阳性的T/NK双向祖细胞，分化为NK系祖细胞，再进一步分化为成熟NK细胞。对不同发育阶段的抗原表达特点，应仔细辨别。

　　【关键词】 NK白血病

　　　Abstract The aim was to investigate the immunophenotypes of NK series leukemia. Immunophenotypes of 297 cases of acute leukemia (AL) were measured by flow cytometry，and these immucopenotypic features were analyzed. The results showed that 43 out of 297 cases of AL (14.5%) were CD56 positive.6 cases were NK series leukemia and 37 cases were acute myelogenous leukemia with CD56 expressed. One patient has been diagnosed as myeloid/NK cell precursor acute leukemia，two patients were blastic NK cell leukemia，one was supposed to be NK-like T-cell lymphoma/leukemia，while another one was large granular lymphocyte leukemia (LGLL). It is concluded that almost all of CD56 positive leukemia were acute myelogenous leukemia with CD56 expressed. The immunophenotypes of NK series leukemia were antigens from hematopoietic stem cells to T/NK progenitor cells with meyloid antigen positive，and through NK progenitors to mature NK cells. The immunophenotypes of heterogeneous NK leukemia cells are different，that should be carefully distinguished.

　　Key words NK leukemia;CD56;flow cytometry

　　从多能造血干细胞分化为成熟NK细胞的途径仍不明确，因此NK细胞系白血病的分析比较困难[1]。对NK细胞来源的恶性血液病最近10年有了较多的报道，它们包括急性前髓系/NK 细胞白血病(myeloid/NK cell precursor acute leukemia)、 伴有早幼粒细胞样形态的急性髓系/NK 细胞白血病(myeloid/NK cell acute leukemia)、原始NK 细胞淋巴瘤/白血病(blastic NK cell lymphoma/leukemia)。这些分型尚未在WHO和新修订的欧美淋巴瘤(REAL)分型中体现。为了进一步认识这些新的白血病类型，仅就我们在临床中发现的从急性前髓系/NK 细胞白血病到大颗粒淋巴细胞淋巴瘤/白血病的NK细胞系白血病，就其免疫表型特征作一报告。

　　材料和方法

　　病例

　　急性白血病共297例，符合FAB诊断标准，绝大部分为中国中医研究院西苑医院病例，少部分为外院在我科流式细胞室检测的病例，年龄15-79岁，男183例，女114例。

　　荧光标记技术

　　将每试管中加入EDTA或肝素抗凝的骨髓100 μl (106/ml)及三色或四色直接标记的荧光抗体10 μl，室温避光孵育20分钟，抗体组合CD34/HLA-DR/CD38、 CD10/CD33、CD19/CD13、CD3/CD56、CD7/CD22、CD3/CD4/CD8、CD5/CD20、MPO/cyCD22、κ/λ、CD41/CD61、CD64/CD69、CD9每管中均加入CD45单克隆抗体;CD56单克隆抗体：克隆N901(NKH1)，以上标记单克隆抗体和阴性对照均为法国Immunotech公司产品。再向各试管中加入溶血素500 μl，震荡置室温避光，10分钟后用500 μl PBS洗涤细胞1次，加入500 μl PBS重悬细胞，上流式细胞仪检测。

　　流式细胞术分析[2]

　　采用美国Beckman-Coulter公司的EPICS-ELITE流式细胞仪，488 nm激发光源，EXPO 32软件进行分析。在使用荧光微球校准及调整机器荧光补偿后，做相应荧光标记同型阴性对照，排除非特异染色的荧光。根据CD45表达程度和SSC颗粒度大小将细胞分为粒细胞群、单核细胞群、淋巴细胞、不成熟淋巴细胞群和不成熟髓细胞群、红细胞和碎片细胞群，经过对各群逐一分析后，确定幼稚细胞群，通过二维表型图谱，分析其抗原表达情况。

　　结果分析

　　以抗原的表达率进行统计，采用抗原阳性标准：cyMPO≥3%，其他抗原≥20%。

　　结 果

　　伴CD56+急性白血病的免疫表型及分化类型

　　297例急性白血病中，CD56阳性43例，占14.5%，CD56阳性细胞率21.4%-98.8%，除1例(例3)为CD3+CD56+外，另42例均为CD3-CD56+。其中6例为 NK细胞系白血病，其余37均为急性髓系白血病伴CD56表达。

　　NK细胞系白血病免疫表型

　　6例NK细胞系白血病免疫表型见附表。例1表达CD34、CD33、CD13、CD7、cyCD3、CD9和CD56，虽细胞膜CD3阴性，但胞浆CD3阳性、MPO阴性，CD56阳性率64.8%，符合急性前髓系/NK 细胞白血病(myeloid/NK cell precursor acute leukemia)。例2表达HLA-DR、CD13、MPO、CD38、CD15、CD64和CD56，形态学极似APL，但无T(15;17)、T(11;17)染色体改变，PML/RARa基因阴性，符合伴有早幼粒细胞样形态的急性髓系/NK 细胞白血病。例3表达HLA-DR、CD7、CD8、CD3+/CD56+阳性率79.6%，是1例NK样T细胞淋巴瘤/白血病(NK-like T-cell lymphoma/leukemia)。例4仅表达HLA-DR和CD56，CD56阳性率87.8%;惜未测定CD4;例5仅表达HLA-DR、CD7、CD4、CD56，CD56阳性率89.3%;CD16、 CD57阴性，虽抗原表达有所不同，此两例均是原始NK细胞白血病。例6仅表达HLA-DR、CD2、CD7、CD9和CD56，CD56阳性率90.1%，此例CD57阳性，是1例大颗粒淋巴细胞白血病(此例外院已确诊为大颗粒淋巴细胞白血病，具典型的大颗粒淋巴细胞形态学表现)。

　　其余37例表达CD56者，共同表达HLA-DR、CD34、CD33、CD13、MPO和CD56，其中4例表达CD41，2例表达CD19，属于急性髓系细胞白血病伴CD56表达。

　　流式细胞仪测定的例1—例6病人CD56表达见图1-6。Table. Immunophenotypes in leukemia of NK cell series(略)

　　讨 论

　　依据免疫表型可以大致推断某一急性白血病处于相应正常造血细胞分化发育的哪一个阶段。另一方面由于白血病是造血细胞的恶性病变，白血病细胞表面抗原的表达与相应正常造血细胞有明显差异。由于从多能造血干细胞分化成熟为NK细胞的途径仍不明确，对NK细胞系白血病的分析比较困难。在NK细胞分化发育过程中，CD56最先表达，CD57、CD16表达较晚。对NK细胞来源的恶性血液病最近10年有了较多的认识，但对NK细胞来源的恶性血液病在分化阶段定位的认识仍有不同。Shibuya等[1]在体外无基质细胞培养中从CD34+CD33+Lin-细胞中诱导分化生成NK细胞;Miller等[3]在有基质细胞培养中证明NK和B淋巴细胞和髓系来源于一个共同的淋巴髓系定向祖细胞。Suzuki 等[4]推理:从多能造血干细胞经历髓系抗原阳性的T/NK双向定向祖细胞，分化为NK定向祖细胞，再进一步分化为成熟NK细胞。与之对应的不同分化发育阶段的恶性血液病是急性前髓系/NK 细胞白血病(myeloid/NK cell precursor acute leukemia)、 原始NK 细胞淋巴瘤/白血病(blastic NK cell lymphoma/leukemia)、大颗粒淋巴细胞淋巴瘤/白血病(NK-LGL leukemia)(图7)。急性前髓系/NK 细胞白血病、原始NK 细胞淋巴瘤/白血病都表达CD56。Scott等[5]也报道了来源于前髓系/NK细胞的急性髓系/NK 细胞白血病。因此，急性白血病伴CD56+CD57-者是一组较大颗粒淋巴细胞淋巴瘤/白血病分化阶段较早的急性NK系白血病，包括如本文所述4种类型。

　　急性前髓系/NK 细胞白血病是一种最近被认识的白血病，其特点是有明显髓外涉及，有不成熟的原始淋巴细胞样形态，伴MPO-、CD7+、 CD33+/CD13+、mCD3-、cyCD3-、CD56+，预后不良。已证明与伴有早幼粒细胞样形态的急性髓系/NK 细胞白血病(myeloid/NK cell acute leukemia)不同，其髓外涉及的活检与原始淋巴细胞淋巴瘤很难鉴别[6]。本研究中例1表达CD34、CD33、CD13、CD7、CD9和CD56，虽细胞膜CD3阴性，但胞浆CD3+，CD56阳性率64.8%，符合急性前髓系/NK 细胞白血病。本研究中例2表达HLA-DR、CD13、MPO、CD38、CD15、CD64和CD56，染色体无t(15;17)、T(11;17)，但有-7，PML/RARa基因阴性，符合伴有早幼粒细胞样形态的急性髓系/NK 细胞白血病(myeloid/NK cell acute leukemia)。例3表达HLA-DR、CD7、CD8、CD38及CD3+/CD56+，经检查HTLV-1排外成人T淋巴细胞白血病，是1例NK样T细胞淋巴瘤/白血病[7]。例4仅表达HLA-DR和CD56，CD56阳性率87.8%，惜未测定CD4;例5表达HLA-DR、CD7、CD4、CD56，CD56阳性率89.3%;CD16 CD57阴性，此2例检测免疫表型同时测定了TCRαβTCRγδ均为阴性，此两例均是原始NK细胞白血病。例6外院已明确诊断为大颗粒淋巴细胞白血病，免疫表型表达HLA-DR、CD2、CD7、CD9、CD56和CD57，形态学表现为典型的成熟大颗粒淋巴细胞。

　　43例CD56阳性病例中37例共同表达HLA-DR、CD34、CD33、CD13、MPO和CD56，其中4例表达CD41，2例表达CD19(因为CD19也可在早期髓系细胞表达，此2例可视为早期髓系)，由于MPO+、CD7-，分析其分化发育阶段较急性前髓系NK 细胞白血病晚，且髓系抗原表达更多。值得注意的是本研究中43例CD56+病例中4例同时为CD41+(其中2例同时CD61+)，占10例CD41+(4/10)的40.0%;我们曾报道63例急性白血病中2例CD41+者均CD56+，可见髓系白血病中表达CD41者CD56+较多[8]。

　　NK细胞系白血病是近10年才较多注意到的白血病，对其临床特点，免疫表型、染色体及基因改变需进一步积累病例研究才能彻底明了。CD56虽然没有细胞系列和疾病特异性，但NK祖细胞和NK样T细胞淋巴瘤/白血病的恶性细胞都表达CD56，表达CD56的淋巴瘤/白血病大多临床表现病情进展迅速[9]。已报到病例以东亚地区明显为多，应引起我们高度注意。据文献〖4]列出NK细胞系白血病免疫表性特点和鉴别诊断：急性前髓系/NK 细胞白血病免疫表型特征: MPO-、CD7+、CD33+/CD13+、smCD3-、cyCD3-、CD56+。形态学特点: 原始淋巴细胞样，细胞大小不等，核不规则，核仁明显，胞浆灰蓝或淡蓝，无嗜天青颗粒或Auer小体，组织化学检测MPO阴性(<3%)，糖原阴性，酯酶阴性。部分病人可有染色体异常(7p和3p异常)。少数急性前髓系/NK细胞的白血病病人有TCRβ、TCRγ、TCRδIgH重排。髓系化疗有效。原始NK 细胞淋巴瘤/白血病免疫表型特征:cyCD3-，CD56+，无髓系和B系抗原。形态学方面的特点: 原始淋巴细胞样，胞浆可有嗜天青颗粒。少数原始NK细胞淋巴瘤/白血病有TCRβ重排，无TCRγTCRδIgH重排。淋系化疗有效。

　　但究竟表达CD56的恶性细胞是否都来自NK细胞系，或表达CD56的急性白血病是否都可称作NK细胞系白血病，都还需要进一步研究。

　　【参考文献】

　　1Shibury A，Nagayoshi K，Nakamura K，et al. Lymphokine requirement for the generation of natural killer cells from CD34+ hematopoetic progenitor cells. Blood，1995;85: 35-38

　　2麻柔，薛向军，公殿广等. 137例急性白血病免疫表型分析.中华血液学杂志，1996;17: 433-434

　　3Miller JS，McCuullar V，Punzel M，et al. Single adult human CD34+/Lin-/CD38- progenitor give rise to natural killer cells，B-lineage cells，dendritic cells，and myeloid cells. Blood，1999;93: 96-106

　　4Suzuki R，Nakamura S. Malignancies of natural killer (NK) cell precursor: myeloid/NK cell precursor acute leukemia and blastic NK cell lymphoma/leukemia. Leuk Res，1999;21: 615-524

　　5Scott AA，Head DR，Kopecky KJ，et al. HLA-DR-，CD33+，CD56+，CD16- myeloid/natural killer acute leukemia: a previously unrecognized form pf acute leukemia potentially misdiagnosed as FAB acute myeloid leukemia-M3. Blood，1994;84: 244-255

　　6Suzuki R，Yamamoto K，Seto M，et al. CD7+ and CD56+ myeloid/natural killer cell procursor acute leukemia: a distinct hematolymphoid disease entity. Blood，1997;90: 2417-2428

　　7麻柔，许勇钢，胡晓梅等. 急性白血病伴CD56阳性的临床意义. 白血病•淋巴瘤，2001;10:265-268

　　8Jaffe ES. Classification of natural killer(NK) cell and NK-like T-cell malignancies. Blood，1996;87: 1207-1212

　　9Loughran TP Jr. CD56+ hematologic malignancies. Leuk Res，1999;23: 675-679