MIF和COX-2在实验性IgA肾病肾组织中的表达

作者：李晓蕾 金晓明 王天真 史炯 张鹏旗

【摘要】  目的 探讨巨噬细胞移动抑制因子（MIF）和环氧化酶2（COX-2）在实验性IgA肾病肾组织中的表达及其相关性。方法 应用葡聚糖G200和大肠杆菌外膜总蛋白（OMPs）提取物分别免疫小鼠，诱导IgA肾病模型，设立葡聚糖组和大肠杆菌外膜蛋白组，同时建立空白对照组。用免疫组化方法检测MIF和COX-2在实验性IgA肾病肾组织中的表达与分布。结果 MIF和COX-2在葡聚糖组和大肠杆菌外膜蛋白组肾小管上皮细胞中的表达显著上调，在两组的表达显著高于空白对照组（P＜0.01﹚。MIF和COX-2在实验性IgA肾病肾组织的表达与肾组织损伤的程度呈正相关。结论 MIF和COX-2在IgA肾病肾组织的表达比较高，提示MIF和COX-2在IgA肾病的发生、发展中发挥一定的作用。

【关键词】  IgA肾病 实验性IgA肾病 巨噬细胞移动抑制因子 环氧化酶-2

    IgA肾病是以肾小球系膜区IgA免疫复合物沉积为特征的一类肾小球肾炎，病理变化以系膜增殖为基本组织学改变，临床上以血尿为主要表现，是导致慢性肾衰竭的最常见原因之一，但其发病机制仍未完全阐明。研究表明，巨噬细胞移动抑制因子（MIF）是一种来源于T淋巴细胞的细胞因子，在免疫介导肾脏疾病中起着重要作用。环氧化酶-2（COX-2）是前列腺素合成的限速酶，COX-2作为诱导酶参与炎症、多种肾脏疾病的发生发展过程。然而，在IgA肾病中国内外有关MIF和COX-2分布及其在病变中意义的报道尚少，本实验旨在观察葡聚糖与大肠杆菌外膜蛋白诱导IgA肾病肾组织中MIF和COX-2的表达及两者的相关性。

　　1  材料与方法

　　1.1  动物模型建立与分组

　　4周龄昆明雄性小鼠，重17~23g，共52只（购自哈尔滨兽医研究所实验动物中心）。分外膜蛋白（OMPs）组，葡聚糖（Dextran）组，空白对照组。OMPs组皮下注射大肠杆菌与弗氏佐剂（购自Sigma公司），1次/周，连续3周，3周后尾静脉注射抗原。Dextran组用DextranG-200（2mg/ml）预免疫，于1，7，10日等体积混合弗氏完全佐剂皮下注射，第2周后每周一次为静脉注射相同抗原。对照组仅注射生理盐水，共20周。

　　1.2  临床指标检测

　　定期收集动物尿液监测蛋白含量，尿红细胞，断尾采血测血清肌酐、尿素氮值。

　　1.3  肾组织病理

　　20周末断头法处死动物，收集血液；双侧肾脏取材，分别行冰冻切片IgA免疫荧光染色；石蜡包埋,HE染色观察肾小球系膜增生程度及淋巴细胞浸润等情况；2.5%戊二醛固定组织电镜观察系膜区是否有免疫复合物沉积及肾小球细胞超微结构变化。

　　1.4  MIF和COX-2的测定

　　采用免疫组化SP法,免抗鼠MIF多克隆抗体(福州迈新生物技术开发公司提供)和免抗鼠COX-2多克隆抗体(北京中杉金桥技术有限公司提供)稀释浓度均为1∶80，SP试剂盒和DAB显色剂均购于北京中杉金桥技术有限公司。用PBS液代替一抗作阴性对照，将已知MIF和COX-2阳性切片作阳性对照。MIF和COX-2的表达主要位于肾小管上皮细胞内，均呈现棕黄色细颗粒。镜下读片，每张切片随机观察，根据阳性细胞占同类细胞总数的百分率及细胞染色强度综合判定。基本不着色为0分，着色淡者为1分，着色适中者为2分，着色深者为3分；着色细胞占计数细胞百分率≤5%为0分，6%~25%为1分，26%~50%为2分，＞50%为3分。将每张切片着色程度得分与着色细胞百分率得分之和作为最后得分，0~1分为阴性（-），2分为弱阳性（+），3~4分为阳性（++），5~6分为强阳性（+++）。

　　1.5  统计方法

　　两个独立样本的等级资料采用非参数Mann-Whitney检验，相关性采用非参数Spearman相关分析。所有统计都在SPSS12.0统计软件中完成。P<0.05为差异有统计学意义。

　　2  结果

　　2.1  不同实验组处死时尿蛋白、血清尿素氮(BUN)、血清肌酐(Scr)含量比较

　　小鼠尾静脉注射OMPs悬液后，萎靡不振；1周后开始出现蛋白尿，6周后达到平台期，处死时平均尿蛋白总1963.2mg/L。葡聚糖组动物一般情况较好，平均蛋白尿浓度为4845.1mg/L，两组之间无显著差别（P>0.05），均显著高于对照组。OMPs与葡聚糖组均出现血尿，对照组始终未见血尿。见表1。表1  不同实验组处死时尿蛋白、血清尿素氮(BUN)、血清肌酐(略) 注：*P<0.05

　　2.2  小鼠肾脏病理学检查

　　HE染色葡聚糖组肾小球数轻度增加，皮髓交界处肾小球肿胀明显。肾脏系膜不同程度增生，系膜细胞增多，间质淋巴细胞浸润，间质血管充血、水肿。OMPs组系膜增生不明显，仅见小管间质大量炎细胞浸润。免疫荧光检测显示葡聚糖组大部动物肾小球内可见IgA复合物沉积；OMPs组少数标本呈弱阳性。电镜结果显示肾小球内系膜细胞增多，葡聚糖组系膜区可见中等量高密度电子致密物沉积。

　　2.3  MIF和COX-2免疫组化结果

　　空白对照组肾组织仅少部分肾小管上皮细胞有MIF和COX-2的微弱表达，而两组诱导IgA肾病模型中MIF和COX-2在肾小管上皮细胞表达增加，阳性率均达95.5%。在葡聚糖组和OMPs组MIF和COX-2的表达显著高于空白对照组（P<0.01），葡聚糖组和OMPs组比较，差异无显著性（P>0.05）。见表2。表2  MIF和COX-2在IgA肾病模型中不同实验组肾脏的表达（略）

　　2.4  MIF和COX-2表达的相关性

　　葡聚糖组22例中，有20例MIF和COX-2表达均为阳性，经Spearman相关检验发现两者表达呈显著正相关（r=0.643，P<0.01）。OMPs组20例中，有18例MIF和COX-2表达均为阳性，经Spearman相关检验发现两者表达呈正相关（r=0.519，P<0.05）。

　　3  讨论

　　IgA肾病是全世界范围内发病最为广泛的原发性肾小球肾炎［1］，为了进一步阐明其发生机制，人们设计或发现了许多IgA肾病动物模型，为IgA肾病提供了实验平台。本实验分别用葡聚糖G200和大肠杆菌外膜总蛋白提取物免疫小鼠，诱导了IgA肾病模型。但两种方法比较，葡聚糖G200组肾脏IgA复合物沉积率较高。最近，Sharmin等［2］报道利用密度梯度离心法提取金黄色葡萄球菌外膜蛋白，成功诱导了IgA肾病模型，免疫及电镜检测IgA系膜沉积显著增高。MIF是含有115个氨基酸的蛋白质，分子量12.5KD，具有由a链和β链组成的三维结构。MIF与炎症和免疫反应有关，在细胞生长和分化中起重要作用。许多学者报道［5-7］，在正常人、大鼠的肾组织中，MIFmRNA和蛋白质主要在肾小球脏层上皮细胞表达，在肾小管上皮细胞弱表达。Yoshikiko等［8］报道，IgA肾病患者的肾活检标本中发现肾小管上皮MIF的表达上调，同时发现增生的系膜细胞也可以有MIF的表达。本实验中两组诱导IgA肾病模型中MIF在肾小管上皮细胞的表达上调，也提示MIF与IgA肾病的进展有一定关系。Leung等［9］研究证实多聚IgA在体外可上调人肾小球系膜细胞MIF和TNF-a的表达，应用中和抗体阻断TNF-a表达可减少MIF表达，故多聚IgA可能是诱导IgA肾病肾组织内MIF表达增加的首要原因。张雪光等［10］报道，随IgA肾病病变加重，肾小球和肾小管间质内MIF的表达和浸润的巨噬细胞数明显增多，MIF表达和巨噬细胞数之间存在明显的相关性，提示MIF表达上调及其所致巨噬细胞浸润的增加通过加重炎症可使病变恶化，加速本病的进展。环氧化酶是花生四烯酸转化为前列腺素过程中的限速酶，它的两个同工酶COX-1和COX-2的基因结构不同，COX-1在许多组织中表达并且在组织稳态中起作用。而在多数细胞和组织中COX-2是诱导型，但在细胞受到各种刺激，如炎症介质、生长因子、细胞因子、促癌剂等的诱导下迅速合成，参与炎症过程和肿瘤的发生。Harris等［3］首先在正常成年大鼠的肾脏检测到含量较低COX-2 mRNA，在肾皮质和乳头部的微粒体中也检测到了免疫反应性COX-2。用原位杂交和免疫组化的方法发现，COX-2 mRNA和免疫反应性蛋白定位于成年大鼠肾皮质的致密斑（maculadensa）和近皮质的Henle袢升支粗段（cortical 　thick ascending limb  of  Henle，cTALH）的细胞。绝大多数的肾小球旁器的致密斑无COX-2阳性的细胞。小动脉、肾小球、皮质和髓质的集合管均无COX-2免疫反应。本实验中，葡聚糖组COX-2在肾小管上皮细胞中弥漫性表达，OMPs组COX-2主要在远曲小管上皮细胞散在表达。而在空白对照组呈阴性或弱阳性表达，提示COX-2表达在IgA肾病出现上调。COX-2是炎症相关的酶，在炎症状态下，在内皮细胞、巨噬细胞和成纤维细胞中可以被炎症因子诱导［4］。本实验两组诱导IgA肾病模型中，均有一定程度的系膜细胞（MC）增生和炎症反应。MC受到刺激后可以产生大量的血管活性物质，对肾脏的免疫和炎症反应有重要的调节作用。研究表明，MC受一些细胞因子刺激后COX-2的表达在mRNA水平和蛋白质水平均显著增加，与此同时MC所合成的炎症介质PGE2也显著增加，加重局部炎症反应。本实验中，IgA肾病模型中MIF表达和COX-2表达呈正相关，提示IgA肾病中MIF和COX-2之间有协同作用，MIF作为炎症因子可能诱导COX-2的表达，其间相互作用、相互影响的机制，还需分子生物学的深入研究。综上所述，对MIF和COX-2的深入研究可进一步为阐明IgA肾病的发病机制提供依据，同时为IgA肾病的治疗提供新的靶点。

【参考文献】  　［1］Magistroni R,Furci L,Leonelli M,et al.A validated model of disease progression in IgA nephropathy［J］.J Nephrol,2006，19(1):32-40

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　　［9］Leung JC,Tang SC,Chan LY,et al.Polymeric IgA increases the synthesis of macrophage migration inhibitory factor by human mesangial cells in IgA nephropathy［J］.Nephrol Dial Transplant，2003，18（1）:36-45

　　［10］张雪光，师锁柱，陈香美，等.巨噬细胞移动抑制因子在IgA肾病中的表达及意义［J］.中国组织化学与细胞化学杂志，2006，15（3）：313-317