跨越断裂位点PCR检测α地中海贫血基因缺失

　　作者：李志玖1,2， 郑 芳1*， 燕 平2 作者单位：(1武汉大学医学部第二临床学院,湖北 武汉 430071;2郧阳医学院附属太和医院肿瘤科,湖北 十堰 442000)

　　【摘要】 目的:运用跨越断裂位点PCR (GAPPCR)法检测α地中海贫血(αThal)基因缺失类型,评价临床应用的可行性。方法:对213 例临床疑诊为αThal患者血液标本进行GAPPCR法检测。结果:αThal基因缺失阳性率为42.34%(90/213), 其中SEA为 32.39%,α3.7为7%,α4.2为1.88%，GAPPCR法检测敏感度、特异度和准确度均为100%。结论:GAPPCR检测αThal基因缺失类型结果准确,操作简便,为诊断和筛查αThal的有效方法。

　　【关键词】 α地中海贫血;跨越断裂位点-聚合酶链反应;基因诊断

　　Detection of αThalassemia Gene Deletion with GAPPCR LI Zhijiu1,2，ZHENG Fang1*，YAN Ping2 (1Department of Clinical Laboratory,Second Teaching Hospital,Medicine Division,Wuhan University,Wuhan,Hubei 430071;2Department of Oncology,Taihe Hospital,Yunyang Medical College,Shiyan,Hubei 442000,China)

　　Abstract:Objective To estimate the feasibility of GAPPCR in detecting αThalassemia gene deletion and the deletion type as well. Methods The blood samples of 213 patients with clinically suspected αThalassemia were detected with GAPPCR. Results The positive rate of αThalassemia gene deletion was 42.34% (90/213),and the type of  SEA accounted for 32.91%,the type of α3.7 accounted for 7% and the type of α4.2 1.88%;the rate of sensitivity,specificity and accuracy were all 100%.Conclusion The GAPPCR could be a simple,accurate and efficient method for screening and diagnosis of αThalassemia.

　　Key words:αThalassemia;GAPPCR;Gene diagnosis

　　α地中海贫血(Thalassemial,αThal)是一种由于编码血红蛋白的基因发生突变，造成α珠蛋白肽链表达合成异常所致的常染色体单基因遗传病,多发于我国南方特别是华南、西南等地,中国人群主要为α3.7,α4.2 ,SEA三种缺失型[1]。传统检测方法不能对αThal患者及致病基因携带者做出分子诊断[2],随着PCR技术的不断发展和改进,αThal基因诊断检测技术日趋成熟。本文采用跨越断裂位点PCR (GAPPCR)检测技术,对213例疑似α地中海贫血患者进行基因水平的诊断,以加强婚前及产前筛查,为防止重型地中海贫血儿出生,减少杂合子胎儿提供有利帮助。

　　1 资料和方法

　　1.1 研究对象

　　在本院筛查疑诊为α地中海贫血病人或携带者213例,男98例,女115例,年龄为出生后6月-40岁。所有对象均空腹抽取3 mL静脉血,EDTAK2 抗凝, 4 ℃保存待检。

　　1.2 外周血白细胞分离

　　采集3 mL EDTA抗凝静脉血,3 000 r/min离心2.5 min,弃上层血浆,注意不要吸掉中间白细胞层;加入5倍体积的红细胞裂解液,混匀,3 000 r/min离心2.5 min,弃上清,但保留沉淀的白细胞;重复1次后加入5 mL生理盐水,混匀,使白细胞恢复等渗环境,3 000 r/min离心5 min,弃上清;将白细胞冻存于- 20 ℃，或按酚/氯仿法提取DNA,稍加晾干后,溶于60 μL TE中。

　　1.3 GAPPCR检测

　　按α地中海贫血基因型检测试剂盒(达安基因诊断中心)说明书进行。每只薄壁微量离心管内含分装好的20 μL PCR反应混合物(10 ×PCR反应缓冲液 2.5 μL,25 mmol/L MgCl2 2 μL,2.5 mmol/L dNTP 200 μL,10 mg/mL BSA 0.25 μL,β巯基乙醇0.02 μL,二甲基亚砜(DMSO)1.6 μL)。引物加入Taq DNA聚合酶1 U,基因组DNA 0.1 μg,在PE 400仪上96 ℃预变性15 min,98 ℃变性15 s,64 ℃退火1 min,72 ℃延伸3 min,共35个循环,最后72 ℃延伸5 min。PCR结束后取PCR产物10 μL,加入2 μL 6 ×溴酚蓝上样缓冲液,混合后加样于12 g/L琼脂糖凝胶电泳60～90 min,凝胶成像仪下观察。

　　2 结果

　　图1为αThal患者DNA电泳图谱。0.8 kb条带表示SEA缺失,1.6 kb条带表示α4.2缺失,2.0 kb条带表示α3.7缺失,1.8 kb条带表示正常α珠蛋白基因 (αα)或非缺失型α珠蛋白基因。

　　GAPPCR 法检测的213例血液本中，αThal缺失型比例为42.31%，αα/SEA、α3.7/SEA、α4.2/α α、α3.7/αα的例数分别为69(32.39%)、15(7%)、4(1.88%)、2(0.94%)，其检测灵敏度、特异度、准确度、阳性预测值和阴性预测值为100%。

　　图1 GAPPCR法检测α2珠蛋白生成障碍性

　　贫血PCR产物琼脂糖凝胶电泳图

　　M:Marker;1～4：αα/SEA;5:-α3.7/SEA;6:正常人DNA(αα/αα);7:α4.2/α α;8：α3.7/αα

　　3 讨论

　　地中海贫血是一组由于珠蛋白基因突变,使珠蛋白生物合成受阻、产量不足或缺如所致的常染色体隐性遗传病,是我国长江以南各省发病率最高,影响最大的遗传病之一[1]。常见类型是α地中海贫血和β地中海贫血。由于目前对地中海贫血尚无有效的治疗方法,因此加强地中海贫血基因携带孕妇婚前及产前筛查,在妊娠早期进行产前基因诊断，以防止地中海贫血儿出生是最有效的预防措施。

　　地中海贫血的基因诊断和产前诊断经历了DNA斑点杂交、限制性内切酶酶谱分析、限制性片段长度多态性(RFLP)分析、寡核苷酸(ASO)探针杂交和PCR体外基因扩增等阶段,突变特异性扩增系统(ARMS)法[3]、反向点杂交法(RDB)[4]和跨越断裂点的PCR扩增法(GAPPCR)[5]是获得认可且已推广的方法，但由于费用昂贵、手续复杂、耗时长等因素，使得GAPPCR检测技术备受青睐。

　　跨越断裂位点PCR(GAPPCR)，也叫缺口PCR，该法是在断裂点附近的上游和下游分别设计正向引物和反向引物,这样可通过PCR产物直接确定被检测DNA基因型,即在缺失型基因SEA 5′端断裂点上游和3′端断裂点下游设计一对特殊性引物,中国人最常见的缺失型αThal基因为东南亚型(SEA/)。由于该突变基因片段长约20 kb,因此不能扩增出正常等位基因片段,而在SEA等位基因位点因基因缺失而靠近,从而能特异地扩增出代表该缺失突变存在的阳性DNA片段。体系中的内对照引物对位于常见缺失基因SEA、α3.7和α4.2的公共缺失区域,用以扩增正常α珠蛋白等位基因,可扩增出正常对照带，从而能很好地区分正常子、杂合子和纯合子，故在一个反应管中能同时检测中国人群常见的3种缺失类型。

　　该法的优势在于在单管中进行多重PCR,简化了操作步骤,减少加样机会,降低污染的可能性,并可节约样品和试剂,降低费用。此外由于正常基因和缺失基因在同一体系中扩增,有利于PCR的质量控制,提高反应体系的可靠性。该法设计的引物在SEA、α3.7、α4.2突变的公共缺失区域,所以其扩增产物可用作缺失型αThal、非缺失型αThal的判别标志。本方法检测的213例临床疑诊标本,其灵敏度、特异度和准确度均符合临床检测要求，各基因型的频数分布也与文献报道结果一致[6]。用于α地中海贫血的诊断和筛查具有快速、简便、准确、经济等特点,适合临床推广应用。

　　当然，也可以运用多重等位基因特异性PCR法，其优势是在一个PCR体系中包含有4 对等位基因特异性引物，可根据每个突变位点的特异性扩增结果加以判断，对重型β-地中海贫血检测效果也较好[7]。

　　【参考文献】

　　[1]刘敬忠,王立荣,黄莉嘉,等.α地中海贫血的基因诊断及产前诊断研究[J].中华血液学杂志,2005,26(2):103-105.

　　[2]郭柳薇.地中海贫血基因检测的研究进展[J].医学综述,2006,12(24)：1 478-1 480.

　　[3]Newton CR,Graham A,Heptinstall LE,et al.Analysis of anypoint mutation in DNA amplification refractory mutation system(ARMS)[J].Nucl Acid Res,1989,17(7):2 503-2 516.

　　[4]Saiki PK,Walsh PS,Levenson CH,et al.Genetic analysis of amplified DNA with immobilized sequencespecific oligonucleotide probes[J].Proc Natl Acad Sci USA,1989,86(16):6 230-6 234.

　　[5]Chang JG,Lee LS,Lin CP,et al.Rapid diagnosis of αthalassemia1 of southeast Asia type and hydrops fetalis by polymerase chain reaction[J].Blood,1991,78(3):853-854.

　　[6]李泽松,李建新,张 文,等.多重聚合酶链反应在地贫诊断中的应用[J].中华检验医学杂志,2005,28(3):247-250.

　　[7]Baig SM.Molecular diagnosis of betathalassemia by multiplex ARMSPCR:a cost effective method for developing countries like Pakistan[J].Prenat Diagn,2007,27(6):580-581