多重聚合酶链反应在缺失型ɑ-地中海贫血诊断中的应用

　　作者：钟莉 何雅军 杨小华 作者单位：广州市红十字会医院 检验科， 广东 广州

　　【摘要】 目的： 探讨多重聚合酶链式反应(PCR)在缺失型ɑ-地中海贫血患者基因类型快速诊断中的应用价值。方法：对应用多重PCR进行ɑ-地中海贫血检测后确诊为正常的30份样本及缺失型ɑ-地贫的78份样本进行基因类型及血液实验学参数的回顾性比较与统计分析。结果：在78例缺失型ɑ地中海贫血中，8例为左缺失静止型ɑ-地贫(-ɑ3.7/ɑ ɑ)、3例为右缺失静止型ɑ-地贫(-ɑ4.2/ɑ ɑ)、60例为东南亚型缺失ɑ-地贫(--sea/ɑ ɑ)、5例为左缺失血红蛋白(HbH)病(--sea/-ɑ3.7)、2例为右缺失血红蛋白(HbH)病(--sea/-ɑ4.2)，分别占缺失型ɑ-地贫的10.3%、3.8%、76. 9%、6.4%、2.6%。静止型ɑ-地贫血液学参数MCV为(84.0±3.76)fl，红细胞脆性为(68.0±12.7)%;东南亚(标准)型ɑ-地贫MCV为(71.7±5.1)fl，红细胞脆性为(42.3±15.2)%;HBH病MCV为(61.9±5.0)fl，红细胞脆性为(25.0±6.5)%。结论：与传统的血液学参数筛查比较，多重PCR可以准确、简便、快速地检测常见的-ɑ3.7、-ɑ4.2、-- sea3种缺失型ɑ-地贫，对静止型ɑ-地贫的检出是一种较为理想的方法。

　　【关键词】 多重聚合酶链反应;ɑ-地中海贫血;缺失型ɑ-地中海贫血;基因诊断

　　Application of Multiplex PCR for Detecting Genotypes of Deletional ɑ-Thalassemia

　　ZHONG Li HE Yajun YANG Xiaohua

　　(The Clinical Laboratory of GuangZhou Red Cross Hospital，Guangzhou510220,China)

　　Abstract: Objective To investigate the clinical application of multiplex polymerase chain reation (M-PCR)in detecting genotypes of deletionalɑ-thalassemia patients. Methods Gene types and blood parameters of 78 ɑ-thalassemia samples confirmed by multiplex polymerase chain reation were analyzed and compared with those of 31 controls retrospectively. Results Among 78 deletional αthalassemia patients with gene deletion,5 patients with-- sea/-ɑ3.7(6.4%)、2with-- sea/-ɑ4.2(2.6%)、60with-- sea/-ɑ3.7/ɑ ɑ(76.9%)、8with-α3.7/α α(10.3%)and 3with-α4.2/αα(4.2 %) were found. Mean corpuscular volume(mcv) of stationary ɑ-thalassemia、standard ɑ-thalassemia、 Hemoglobin H disease were (84.0±3.76)fl、 (71.7±5.1)fl、(61.9±5.0)fl respectively and Red cell Ozmotic fragility were (68.0±12.7)% 、(42.3±15.2)%、(25.0±6.5)% respectively. Conclusion Multipex PCR analysis is a simple, rapid and accurate method for detection of ɑ -thalassemia gene deletion .this technique is helpful in screening、stationary ɑ-thalassemia.

　　Key words: multiplex-PCR; ɑ-thalassemia;deletional ɑ-thalassemia;gene deletion

　　ɑ-地中海贫血是由于ɑ珠蛋白链基因缺失或功能缺陷导致ɑ链合成受抑制所致的一组血红蛋白病，是常见的人类单基因遗传病之一，在我国广西、广东地区ɑ-地贫的发生率达到8%以上[1,2]。ɑ珠蛋白基因位于第16号染色体上，共4个基因，根据4个ɑ基因的缺失的不同，临床上ɑ-地贫分为静止型、标准型、中间型和重型。中间型和重型ɑ-地贫可依靠血液学参数进行筛查，标准型ɑ-地贫临床症状不明显，也可无贫血症状但可依靠血液学方面指标进行筛查，静止型ɑ地贫除了临床症状不明显，无贫血症状之外，从血液学参数方面也不容易筛查出来。以PCR为基础的检测方法已应用于ɑ-地贫的确诊诊断和类型辨别，并经历了单重、双重和多重几个阶段[3,4]。本实验应用多重PCR检测缺失型ɑ-地贫，对ɑ-地贫各种表型的血液学实验参数进行回顾性统计分析，目的在于评价多重PCR在检测缺失型ɑ-地中海贫血中的应用价值。

　　1、材料与方法

　　1.1 标本来源：收集2006年2月至2006年10月经多重PCR诊断为缺失型ɑ-地贫患者的78份血液标本，其中男性33例，女性45例;正常对照30例，其中男女各15例。年龄从2岁至45岁，均为广东籍，其间无亲缘关系。

　　1.2 血液学检测：抽取肘静脉血2ml于EDTA抗凝管中，于2h内用Sysmex KX21自动血细胞分析仪测定平均红细胞体积(MCV)、平均红细胞血红蛋白含量(MCH)等红细胞参数，每日用四川通广公司提供的室内血细胞全血质控物进行质控。然后采用中山大学遗传教研室的红细胞脆性一管定量法试剂测定红细胞脆性，每次检测均设正常对照。以MCV>80fl，MCH>26pg，红细胞脆性>60%为正常。

　　1.3 血红蛋白电泳：使用美国海伦娜公司的全自动电泳仪及相应试剂，按操作说明书进行。HbA2正常参考范围为(2.5-4.0)%

　　1.4 DNA抽提：每人取2ml静脉全血于ACD(柠檬酸纳)常规抗凝管中，混匀后存于4℃于72小时内用全血DNA提取试剂盒(Gentran 公司)按操作说明书进行抽提。

　　1.5 多重PCR扩增：使用深圳益生堂生物企业公司生产的ɑ-地中海贫血基因诊断试剂盒，按说明书进行操作。

　　1.6 PCR产物的电泳分析：配制1.0%琼脂糖凝胶板，以溴化乙锭(EB)为染色剂，取每管PCR产物10?滋1,分别加2?滋1电泳加样缓冲液，混匀，依次加入1.0%琼脂糖凝胶加样孔中。取DNA分子量标准Mark8.0?滋1,直接点样。稳压6-8V/cm gel，电泳约100min，停止电泳，UVP或UV灯下观察结果。

　　1.7 统计学分析：采用SPSS10.0分析软件，各组与正常对照组比较采用t检验。

　　2、结果

　　2.1 正常对照组30例，基因型全部为ɑ ɑ/ɑ ɑ;ɑ-地贫组78例，基因型全部为缺失型，其中8例为-ɑ3.7/ɑ ɑ、3例为-ɑ4.2/ɑ ɑ、60例为--sea/ɑ ɑ、5例为--sea/-ɑ3.7、2例--sea/-ɑ4.2，分别占缺失型ɑ-地贫的10.3%、3.8%、76.9%、6.4%、2.6%;在11例静止型ɑ-地贫的血液学参数结果中，9例红细胞脆性百分率>60%、10例MCV>80fl、8例MCCH> 26pg、6例HbA2>2.5%。见表1。

　　表1 PCR检测和血液学方法检测结果比较

　　2.2 以正常组为对照，按ɑ-地贫的临床表型进行分组对ɑ-地贫各组进行血液学实验参数分析并对其进行统计学计算，结果标准型ɑ-地贫组和HbH病组血液学实验参数差异均有统计学意义(P<0.05)，静止型ɑ-地贫MCV(84.0±3.76)fl、红细胞脆性(68.0±12.7)%、血红蛋白A2(2.51±0.38)%均处于正参考范围。见表2。

　　表2 ɑ-地贫各种表型血液学指标及红细胞脆性试验结果比较(x±s)

　　注：与正常对照组比较*为P<0.05，**为P<0.01

　　3、讨论

　　广东是ɑ-地中海贫血的高发地区，有研究表明在广州地区儿童ɑ-地贫的发生率达到8.56%。由于该病目前尚无根本有效的治疗方法，开展高危人群筛查、婚前和产前诊断成为防止该病发生的最重要措施[5,6]。目前在国内的一些医院主要使用红细胞脆性一管定量法联合红细胞参数、血红蛋白电泳分析对ɑ-地贫进行筛查。这种筛查方法虽然简便易行，技术要求不高，但诊断的灵敏度和特异性不能很好的满足临床的需要。所以开展多重PCR基因检测技术对疑似ɑ-地贫患者进行基因检测具有十分重大的意义[7,8]。

　　本实验对78例应用多重PCR诊断为缺失型ɑ-地贫的样本进行血液学实验参数统计分析和缺失型基因类型的构成比分析，以此评价多重PCR与血液学实验参数这两种方法在诊断ɑ-地贫患者中的应用价值 。实验表明东南亚型缺失(--sea/ɑ ɑ)是主要的缺失类型，占缺失型ɑ-地贫的76.9%(60/78),这与其他研究文献报道比较一致[1]，左缺失(-ɑ3.7)和右缺失(-ɑ4.2)静止型ɑ-地贫占缺失型ɑ-地贫的14.1%(11/78)，左缺失(-ɑ3.7)和右缺失(-ɑ4.2)HbH病占缺失型ɑ-地贫占9%(7/78)，多重PCR可对缺失型ɑ-地贫进行基因分型和类型辨别。

　　目前在国内大多数医院中应用血液学实验参数进行地贫筛查时把MCV<80fl、MCH<26pg、红细胞脆性百分率小于60%作为截断值，再结合HbA2含量进行ɑ-地贫的诊断[9]。本实验60例标准型ɑ-地贫中56例MCV<80fl、60例MCH<26pg、51例红细胞脆性<60%、47例HbA2<2.5%;7例HbH病中所有血液学参数符合诊断值标准，从中可看出血液学实验参数对血红蛋白H病和标准型ɑ-地贫有较好的诊断率。但在11例静止型ɑ-地贫中，有10例MCV>80fl、8例MCH>26pg、9例红细胞脆性>60%Hb、6例HbA2>2.5%，从中可看出血液学检测指标对静止型ɑ-地贫的诊断灵敏度及特异性较差。本实验结果表明把MCV<80fl、MCH<26pg、红细胞脆性<60%和HbA2>2.5%作为初步诊断ɑ-地贫与非ɑ-地贫的标准，可能使地贫筛查过程中漏掉部分静止型ɑ-地贫。多重PCR可同时对东南亚型、左缺失型和右缺失型ɑ-地贫进行有效、特异的检测，特别是对静止型ɑ-地贫可进行基因分型。从ɑ-地贫的分子遗传基础上分析，HbH病的基因类型常见为-- sea/-ɑ4。2和-- sea /-ɑ3.7两种，是左缺失或右缺失静止ɑ-地贫与东南亚缺失标准型之间的相互组合的结果。因此，筛检出静止型ɑ-地贫基因携带者就具有了十分重要的意义，尤其对儿童意义更为重大，因为在其以后婚配过程中可合理指导，防止将异常基因传给下一代，造成地贫基因的蔓延，有利于优生优育。本实验结果显示如果在产前检查时夫妇一方被诊断为东南亚缺失(-- sea/ɑ ɑ)，另一方尽管其血液学实验筛查各项指标均属正常的情况下也建议做基因诊断以排除其静止型ɑ-地贫的可能，

　　防止Hb病小孩的出生。因此，多重PCR对ɑ-地中海贫血携带者的检出是一种较为理想的方法。

　　【参考文献】

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