热疗联合足叶乙甙对K562体外抑制效应及bcl2的表达

　　作者：魏红梅,郭坤元,梅家转,常红,宋朝阳,邓兰,牛新青 作者单位：510280 广州市南方医科大学珠江医院血液科

　　【摘要】 目的 观察热疗联合足叶乙甙增强对K562的体外增殖的抑制作用及对其凋亡、bcl2表达的影响。方法 采用MTT法测定确定VP16的工作浓度，以该浓度进行化疗或与热疗的联合，选择温度40℃、42℃，体外作用于K562。48小时及作用前均采用台盼蓝拒染法检测肿瘤细胞的存活率;MTT法检测对肿瘤细胞增殖的抑制作用;流式细胞仪检测作用后肿瘤细胞的凋亡及bcl2的表达。观察热疗联合足叶乙甙的抗肿瘤作用。结果 以作用48小时IC50的值作为实验的工作浓度。单纯40℃、42℃热疗60分钟在48小时对K562细胞系有抑制作用(P<0.01)，并随温度增高而增强;单纯化疗对K562细胞系也有明显抑制作用(P<0.01);热化疗组在40℃、42℃温度下，对K562均有显著的抑制作用(P<0.01)，随着温度的增高而增强。热疗组、化疗组、热化疗组细胞凋亡率均较对照组显著升高，各组之间均有显著性差异(P<0.01);bcl2蛋白的表达下降，各组之间也有显著性差异(P<0.01)。结论 热疗联合足叶乙甙能增强对K562细胞的体外抑制作用;热化疗联合应用可以提高肿瘤细胞的凋亡率，下调bcl2的表达。

　　【关键词】 足叶乙甙;热疗;K562;凋亡;bcl2蛋白

　　The Suppression Effect and bcl2 Expression of K562 with Etoposide and Hyperthermia in Vitro

　　WEI Hongmei, GUO Kunyuan,MEI Jiazhuan, CHANG Hong,SONG Chaoyang,DENG Lan,NIU Xinqing

　　Department of Hematology,Zhujiang Hospital of Southern Medical University ,Guangzhou 510280,China　Corresponding Author: GUO Kunyuan, Email:gzyuan@pub.Guangzhou.gd.cn

　　Abstract：Objective To observe the inhibitive effect，the apoptosis and bcl2 expression of K562 cells with etoposide and hyperthermia.Methods The working concentration of etoposide against K562 cells was determined by MTT assay.Then hyperthermia and chemotherapy were used singly or concurrently and the cell survival rates were obtained at 48h.The inhibitive effect was evaluated by MTT assay.The apoptosis rates and bcl2 expression of K562 were determined at 48h by flow cytometric.Results The concentration of etoposide was defined as those of IC50.The 40℃，42℃ hyperthermia of 60min showed obvious inhibition to K562 cells(P<0.01),etoposide chemotherapy or hyperthermia both obviously inhibited the growth of K562 cells(P<0.01),etoposide chemotherapy combined with hyperthermia showed obvious effect to K562 cells.According to flow cytometric analyses,the treatment of hyperthermia and etoposide used alone or concurrently could obviously increase the apoptosis rates and downregulate of bcl2 expression of K562 cells.Conclusion Etoposide chemotherapy combined with hyperthermia showed obvious inhibitive effect to K562 cells. The effect can increase the apoptosis rates and downregulate of bcl2.

　　Key words：Etoposide;Hyperthermia;K562;Apoptosis;bcl2

　　0 引言

　　慢性髓细胞白血病是造血系统的恶性肿瘤，中老年发病较高。化疗是白血病综合治疗的重要组成部分，如何提高肿瘤细胞对化疗药物的敏感性，提高化疗的总体效率是白血病治疗中亟待解决的问题。1992年Majima [1]报道，加热可以显著提高某些肿瘤细胞对化疗药物的敏感性。张洪新等 [2，3]在人肝癌细胞7721、兔鳞癌细胞VX2化疗热增敏问题的研究中亦得出相似结论。

　　本研究使用人源的慢性髓系白血病细胞系K562，观察了足叶乙甙(etoposide, VP16)与热疗(hyperthermia, H)联合对K562体外生长的影响，为临床热化疗联合应用治疗慢性髓系白血病提供实验基础。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 细胞系

　　人慢性髓系白血病细胞系K562为广州医学院蛇毒研究所馈赠，并由我实验室传代保存。置于含10%胎牛血清的RPMI1640中于37℃、5% CO2培养箱中培养。

　　1.1.2 主要试剂

　　RPMI1640培养基是GIBCO公司产品;新生胎牛血清为杭州四季青生物公司生产;四甲基偶氮唑蓝(MTT)购自宝泰克公司;足叶乙甙购自齐鲁药业有限公司。

　　1.1.3 主要仪器

　　ELX800全自动酶标仪、倒置显微镜、电热恒温水浴箱。

　　1.2 方法

　　1.2.1 试验分组

　　试验设对照组(单纯培养)、化疗组、热疗组和热化疗组，热疗和热化疗组各分别设40℃及42℃ 2个温度，共设6组。对照组、化疗组均常规培养在37℃的培养箱中。

　　1.2.2 热疗方法

　　电热恒温水浴箱中加热60 min，温度变化<0.2℃。

　　1.2.3 化疗药物工作浓度的确定

　　足叶乙甙设1.25、2.5、5、10、20 μg/ml 5个浓度组，每组设3个复孔，以MTT 法测定细胞增殖抑制率，以48h IC50的药物浓度作为试验的工作浓度。IC50的数值按IC50计算软件获得。

　　1.2.4 台盼蓝拒染法检测细胞的存活率

　　取处理的各组细胞悬液，使每组细胞数均为5×105，分别吸出0.9 ml均匀细胞液，加0.1 ml 0.4%的台盼蓝染色，在3 min内计数，细胞变蓝者为死细胞，每瓶细胞计数3次，取均值。细胞存活率=活细胞总数/(活细胞总数+死细胞总数)×100%。

　　1.2.5 MTT法测定细胞增殖

　　取对数生长的K562细胞，接种到96孔板中，每孔200μl(103)，分组给予热疗、化疗或热化疗处理，继续培养48h，每孔加入 MTT 20μl，继续培养4h，离心，每孔加入150μl DMSO，用全自动酶标仪，选490 nm为测定波长，测定各孔的OD值，计算细胞增殖抑制率。实验重复3次。细胞增殖抑制率=(对照组OD均值实验组OD均值)/对照组OD均值×100%。

　　1.2.6 流式细胞仪(FCM)检测细胞凋亡

　　取对数生长的K562细胞接种于50 ml的培养瓶，每瓶细胞数为2×105，分组处理后继续培养，48h收集细胞，以冷磷酸缓冲液(PBS)处理，加入300μl DNA染液，FCM检测。试验重复3 次。

　　1.2.7 流式细胞仪检测细胞bcl2表达

　　取对数生长的K562细胞接种于50 ml的培养瓶，每瓶细胞数为2×105，选取41℃为试验温度，分组进行处理后继续培养，48h收集细胞，用PBS处理，加入100μl破膜剂及5μl bcl2/FITC和相应的阴性对照(Mouse IgG1/FITC)FCM检测。试验重复3次。

　　1.3 统计学方法

　　采用SPSS 11.0软件进行统计学分析，数据采用±s及单向方差分析(Oneway ANOVA)。

　　2 结果

　　2.1 足叶乙甙工作浓度的确定

　　MTT实验测得不同浓度1.25、2.5、5.0、10及20μg/ml的VP16作用K562细胞48h的抑制作用分别为(19.6±4.0)%、(32.5±2.4)%、(48.6±3.5)%、(60.8±4.6)%及(79.5±3.8)%。K562对VP16的IC50为5.44μg/ml，并以此药物浓度进行以下试验。

　　2.2 细胞的存活率

　　试验时细胞存活率100%。热疗组、化疗组及热化疗组的细胞存活率较对照组均有统计学意义(P<0.01);热化疗的生存率较热疗组和化疗组显著降低(P<0.01)，见表1。表1 VP16联合热疗对K562细胞的存活率、抑制率及凋亡率的分析(%)(略)

　　2.3 细胞的抑制率

　　单纯热疗对K562细胞系有抑制作用，抑制作用随温度增高而增强(P<0.01);热化疗组对K562有显著的抑制作用，随着温度的增高而增强(P<0.01)。热化疗组与化疗组、热疗组相比均有显著性差异(P<0.01)，见表1。

　　2.4 流式细胞仪检测凋亡

　　在40℃、42℃下，化疗组、热疗组及热化疗组细胞凋亡率较对照组均显著升高(P<0.01);热化疗组的细胞凋亡率较热疗组及化疗组的凋亡率均明显升高(P<0.01)。上述结果均随温度的增加而增强，见表1。

　　2.5 流式细胞仪检测bcl2的表达

　　在41℃下，细胞bcl2的表达率分别为：对照组(53.3±6.1)%、化疗组(30±4.0)%、热疗组(27±1.0)%及热化疗组(14±2.0)%，VP16化疗组、热疗组及热化疗组K562细胞bcl2的表达率与对照组相比均有统计学意义(P<0.01);热化疗组与热疗组、化疗组相比均有显著性差异(P<0.01)。

　　3 讨论

　　热疗与化疗联合在实体瘤中研究较多 [4，5]，对血液病研究不多。根据热疗的基础理论，热疗治疗白血病等恶性血液病应该有很好的疗效，由于白血病等恶性血液病行热疗伴有更高的出血和DIC风险，丁向东等 [6]报道采用全身热疗治疗一例慢性粒细胞白血病-急粒变患者(随访6月完全缓解)，魏红梅等 [7]全身热疗治疗恶性血液病15例，无一例患者出现出血及DIC的风险，初步显示其有效性和安全性。

　　VP16对热疗的影响：足叶乙甙是一种β-D-糖甙，DNA拓扑异构酶抑制剂，能有效诱导细胞凋亡 [8]，是肿瘤细胞有丝分裂S期特异性阻滞药物，是治疗恶性血液病的常用化疗药物之一， 主要作用机制是在DNA复制过程中诱导拓扑异构酶与DNA形成断裂复合物， 触发细胞凋亡或停滞于S期 [9]。由于VP16使大量细胞处于S期，S期对热最敏感 [10]，因此化疗联合热疗能增强对肿瘤细胞的杀伤作用。VP16在急性白血病治疗中作为二线药物，本研究探讨在慢性白血病中是否能取得相似的结果，为治疗慢性髓细胞白血病选择新的药物方面提供经验。

　　加热对细胞的影响：高热对细胞膜具有独特的作用，可改变生物膜的流动性，导致原发的细胞质破坏;高热能抑制细胞DNA、RNA、蛋白质的合成与修复;高热可以改变细胞膜的通透性，提高胞质中的药物浓度。但温热必须达到一定温度对细胞才有杀伤作用，乏氧的肿瘤细胞比正常组织细胞对热更敏感。本实验中看出单纯热疗42℃ 60 min细胞毒性较强，因此在体内尤其是临床应用时既要注意温度过高对正常细胞的损伤(安全性)，又要注意温度不能过低以致影响疗效。

　　为了进一步了解VP16与热疗联合作用于K562体外增殖抑制作用机制，本研究分析了处理后的细胞凋亡和bcl2表达水平的变化。bcl2基因是一种抑制细胞凋亡的基因，在多种肿瘤中表达，尤其是在淋巴瘤、白血病等恶性血液病中。目前bcl2 对细胞凋亡的抑制机制尚不清楚 [11]。关于高温诱发细胞凋亡的发生机制，一方面高温可直接影响细胞结构，另一方面与某些基因异常表达有关。已有证据表明凋亡抑制基因表达增强和(或)凋亡活化基因受抑是白血病发生的机制之一。bcl2基因是从滤泡性淋巴细胞瘤中分离出来的一种癌基因,该基因的编码产物是bcl2蛋白，它不像其他致癌基因那样加速细胞分裂、增殖，而是促进细胞生存，延长细胞寿命 [12]。bcl2蛋白异常高表达使细胞获得病态的生存优势，它是化疗耐药形成的内在生物学基础 [13]，温热可下调bcl2蛋白的表达 [14]。本实验结果表明，VP16与热疗联合可以抑制K562细胞的增殖，并促进其凋亡，下调bcl2 蛋白表达水平，上述结果与杨阳等 [15]、向世强等 [11]及He等 [14]的报道是一致的。热处理后明显提高K562对VP16的敏感性。具体作用机制尚有待于我们进一步探讨。

　　上述研究提示VP16与热疗联合对K562细胞系有明显的抑制作用，为慢性白血病的治疗，尤其是老年白血病的治疗提供了另一条出路及理论基础，但尚需更多的体外实验，选择更多的细胞系为临床应用提供充分的依据。

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