异硫氰酸苯己酯调控组蛋白乙酰化并诱导Molt4细胞凋亡的研究

　　作者：马旭东， 黄轶群， 郑瑞玑 作者单位：福建医科大学 附属漳州市医院血液科，漳州 363000

　　【摘要】 目的 研究异硫氰酸苯己酯(PHI)对淋巴母细胞性白血病Molt4细胞组蛋白乙酰化调控及诱导细胞凋亡的影响。 方法 采用MTT法观察PHI对Molt4细胞增殖的影响;流式细胞术观察细胞凋亡;Western Blot观察PHI作用细胞后组蛋白H3(H3K9，H3K14)、H4(H4K5，H4K8，H4K12，H4K16)乙酰化状态变化及凋亡相关蛋白Bcl2、Caspase9、Caspase8、Caspase3、凋亡底物PARP表达的变化。 结果 PHI可抑制细胞增殖，诱导细胞凋亡;PHI可使线粒体膜蛋白Bcl2，Caspase9及下游Caspase3，凋亡底物PARP表达下降，呈时效及量效关系;而Caspase8未见明显变化。PHI可增加组蛋白H3，H4乙酰化表达。 结论 PHI是一种组蛋白去乙酰化酶抑制剂，调控组蛋白乙酰化水平，影响其表观遗传学，可抑制肿瘤细胞增殖，通过线粒体凋亡途径诱导细胞凋亡,是一种潜在的抗肿瘤新药。

　　【关键词】 异硫氰酸盐类; 组蛋白类; 乙酰化作用; 基因表达调控; 细胞凋亡; 白血病, 淋巴细胞

　　流行病学调查显示，大量食用十字花科植物如椰菜、甘蓝和水芹菜等可以降低肿瘤发生的风险[12]。人们通过研究发现，十字花科植物中含有天然异硫氰酸酯化合物(ITCs)，它们以硫配糖体前体形式广泛存在[3]。迄今人们已经对20多种天然或合成的ITCs进行了研究，发现它们均具有不同程度的防癌抗癌作用。异硫氰酸苯己酯(Phenyhexyle Isothiocyanates, PHI)是一类人工合成的异硫氰酸衍生物。笔者前期的工作已经证明PHI可抑制组蛋白去乙酰化酶活性及其蛋白的表达，并调控HL60细胞的组蛋白乙酰化及甲基化，诱导HL60细胞凋亡[4]。本试验以淋巴母细胞性白血病Molt4细胞株为模型，研究PHI诱导淋巴细胞系白血病细胞凋亡及其机制。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料 PHI(美国 LKT Laboratories公司，批号：243-264)，以75%甲醇配成5 mmol/L存储液。细胞培养用1640(美国Gibico公司);胎牛血清(杭州四季青生物制品公司);Annexin V和PI双染试剂盒(美国BD公司);Bcl2、Caspase3、Caspase9、Caspase8鼠单克隆抗体，PARP、βactin兔多克隆抗体，辣根过氧化物标记的羊抗鼠、羊抗兔的二抗，Western Blot化学发光工作液(美国Santa Cruz公司);AntiacetylHistone H3(抗H3K9，H3K14)、AntiacetylHistone H4(抗H4K5，H4K8，H4K12，H4K16)兔多克隆抗体(美国Upsate 公司);酶标仪(Fax2100,美国Stat公司)

　　1.2 方法

　　1.2.1 细胞培养 Molt4细胞株(武汉大学典型物培养中心)，用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液置37 ℃、体积分数为0.05饱和湿度的CO2培养箱培养，隔天换液传代培养，实验时取对数生长期细胞。

　　1.2.2 PHI对Molt4细胞增殖的影响 取对数生长期细胞，将其浓度调整为1.0×105 mL-1接种于96孔细胞培养板，每孔100 μL，对照组使用75%甲醇，实验组分别加入PHI使终浓度为0,5,10,20,40 μmol/L，每组设6个平行孔，培养24,48,72,96 h后，每孔加入MTT(5 mg/mL)10 μL，继续培养4 h，离心后小心吸去上清，每孔加100 μL DMSO，充分震荡混匀，在酶标仪用双波长492 nm和630 nm测吸光度(D值)，计算细胞增殖率：

　　细胞增殖率(%)=(D实验-D空白)/(D对照-D空白)×100%

　　实验重复3次。

　　1.2.3 PHI对Molt4细胞凋亡的影响 用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基接种于75 mL培养瓶，每瓶接种2×106细胞，细胞浓度为2×105 mL-1，加入PHI使终浓度为0,5,20,40 μmol/L，作用3,7,14 h后收集处理后细胞。按试剂盒说明书操作后，立即行流式细胞术检测。

　　1.2.4 PHI对Molt4细胞组蛋白乙酰化、凋亡相关蛋白影响 细胞接种浓度及处理同前，收集细胞后，预冷PBS 0.06 mol/L洗涤2次，吸干洗涤液。按每1×106 细胞加入 100 μL 裂解液+1 μL酶抑制剂的比例冰上裂解细胞30 min，1 000 r/min 4 ℃离心10 min，吸取中间清亮层。Bradford法进行蛋白定量。以10%或12%的SDSPAGE电泳分离，半干电转移法转膜，室温下摇床封闭1 h，加入用TBS根据不同的一抗稀释不同的浓度，4 ℃过夜，TBS洗涤液洗膜后分别放入用TBS按1∶1 000稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗以及羊抗鼠二抗，室温下摇床作用1 h，TBS洗涤液洗膜后化学发光法显色，X射线底片曝光，以βactin为内参照，X射线胶片扫描后，AlphaDigiDoc 图像分析软件进行分析比较。

　　1.3 统计学处理 SPSS 11.5软件处理数据。常规进行方差齐性检验，正态性检验。计量资料实验数据以x±s表示。多组资料之间的比较采用单因素方差分析;方差不齐采用非参数检验。以P<0.05为差别有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 PHI对Molt4细胞的增殖有抑制作用 不同浓度PHI作用后，Molt4细胞的增殖率随药物浓度的增加及时间的延长而逐渐下降，表现为明显的浓度和时间依赖性。 0,5,20,40 μmol/L PHI作用后，Molt4细胞的增殖率随药物浓度的增加而逐渐下降，表现为明显的浓度依赖性;20 μmol/L PHI作用后，Molt4细胞的增殖率随处理的时间的增加而逐渐下降，表现为明显的时间依赖性(图1A，B)。

　　2.2 PHI能诱导Molt4细胞的凋亡 PHI作用于Molt4细胞3，7，14 h后，流式细胞术结果显示PHI能诱导Molt4细胞凋亡，并具有时间和剂量依赖性(P<0.05，表1)。

　　2.3 PHI对凋亡相关蛋白的影响 Western Blot检测发现PHI作用于Molt4细胞3 h后，内源性途径的线粒体膜蛋白Bcl2，Caspase9及下游Caspase3凋亡底物PARP表达下降，而7 h下降趋势更明显，呈时效及量效关系;而配体受体途径的Caspase8未见明显变化(图2)。 表1 PHI对Molt4细胞早期凋亡的影响

　　2.4 PHI对组蛋白H3、H4乙酰化状态的影响 Molt4细胞在PHI作用下，组蛋白H3、H4乙酰化水平明显增高，呈量效和时效关系。仅处理3 h即出现组蛋白H3(H3K9，H3K14)、H4(H4K5，H4K8，H4K12，H4K16)乙酰化水平升高，7 h后此变化趋势更加显著，与0 μmol/L组比较，H3乙酰化分别增加2.0，2.2，4.0倍。H4乙酰化增加1.3，1.8，1.9倍，H3乙酰化增加程度比H4乙酰化增加更明显(图3)。

　　3 讨 论

　　真核生物中，核心组蛋白N末端受多种酶催化的翻译后修饰，其中组蛋白乙酰化得到较为广泛的研究，一般说来，染色质高乙酰化区域是转录活跃的，而低乙酰化区域是静默的[56]。组蛋白乙酰化的改变与肿瘤的发生、发展有密切的关联。对组蛋白乙酰化研究的深入，发现组蛋白去乙酰化酶抑制剂能通过调节组蛋白乙酰化的水平来调控相关基因的转录，诱导肿瘤细胞凋亡或分化，引起细胞周期的阻滞，调控癌基因及抑癌基因活性，从而达到治疗肿瘤的目的[7]。本研究结果表明，PHI能显著提高组蛋白H3、H4的乙酰化水平，呈量效和时效关系，PHI作用于Molt4细胞后3 h组蛋白H3、H4乙酰化水平即明显提高。笔者前期工作证明了PHI能抑制组蛋白去乙酰化酶的活性及表达水平;同时还证明PHI对组蛋白乙酰化水平调控的高峰期是7～10 h，14 h后即下降[4]。PHI:异硫氰酸苯己酯.

　　PHI对组蛋白乙酰化调控导致Molt4细胞生长抑制和细胞凋亡，实验结果显示PHI对Molt4细胞具有较为明显的抑制增殖作用，并呈浓度和时间依赖性。多数研究表明HDACi通过调节组蛋白乙酰化水平启动细胞凋亡程序诱导细胞凋亡，如丁酸盐1 mmol/L处理Kasumi1细胞系24 h后，凋亡细胞百分数为(48.6±5.4)%,而对照组仅为(7.5±1.9)%[8]。本研究也发现PHI 40μmol/L处理Molt4细胞3 h即有早期凋亡，其凋亡率就由对照组的1.55%上升到12.40%;而40 μmol/L处理PHI:异硫氰酸苯己酯.

　　14 h后，凋亡率高达58.75%，对照组仅为2.31%，此时死亡细胞也增多，达到20.68%。可见PHI能以时间依赖性和剂量依赖性的方式诱导Molt4凋亡，但是大剂量长时间的药物处理细胞，也会引起细胞坏死。

　　抗肿瘤药物诱导肿瘤细胞凋亡通过激活两条主要的凋亡途径，一是配体受体途径，二是内源性途径，受到Bcl2基因家族的调控[910]。多数研究表明HDACi诱导细胞凋亡通过内源性细胞凋亡径途，如Rosato等使用MS275处理HL60、Jurkat、K562细胞时发现较高浓度时活性氧簇升高，损伤线粒体膜蛋白，细胞色素C释放入细胞质，启动细胞内凋亡途径，Rb、Bcl2降解，抗凋亡蛋白mcl1、XIAP表达下降[11]。Pear等使用另外三种HDACi如：Oxamflatin、Depsipeptide、SAHA分别诱导CEMCCRF细胞凋亡，也证实Bid蛋白被切割激活，线粒体膜蛋白损伤[12]。而且这三类药物诱导细胞凋亡不能完全被凋亡酶抑制剂抑制，但是却能被Bcl2过量表达完全抑制，这些都证明内源性细胞凋亡途径在HDACi诱导细胞凋亡中的重要作用。本实验用蛋白免疫印迹法观察在PHI作用下Molt4细胞的凋亡相关蛋白的表达，发现凋亡抑制蛋白Bcl2表达下降，内源性凋亡途径的Caspase9激活，最终启动Caspase级联反应中的效应蛋白Caspase3，凋亡底物核糖体蛋白PARP的降解，而配体受体途径的Caspase8未见明显变化，这些寓示PHI诱导Molt4细胞凋亡，是通过引起线粒体的损伤，启动内源凋亡通路，激活Caspase9、Caspase3，引起细胞凋亡，而凋亡的配体受体途径可能在PHI诱导Molt4细胞凋亡过程中不起主要作用。

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