含bcl2启动子绿荧光病毒载体的构建及在白血病HL60和K562细胞中的表达

　　作者：卓光生　 作者单位：福建医科大学 附属第一医院血液科，福州 350005

　　【摘要】 目的 应用pEGFP1质粒构建含有bcl2启动子(bcl2P)的载体，转染高表达bcl2的HL60细胞和低表达bcl2的K562细胞，测定绿荧光蛋白在2种细胞中的表达程度，观察特异性启动子能否引导目的基因在靶细胞表达，达到基因定位的目的。 方法 克隆bcl2P，采用pEGFP1质粒构建含有bcl2P的载体;应用电击法转染pEGFPBCL2P DNA到HL60和K562细胞并培养;测定EGFP在HL60细胞和K562细胞中的表达。 结果 成功构建含bcl2P绿荧光病毒载体pEGFPBCL2P，绿荧光的表达率在HL60及K562细胞分别为64.29%及0.5%。表达绿荧光阳性的HL60细胞在培养30 d后仍有89.6%的细胞表达阳性。 结论 绿荧光在HL60细胞中有较稳定的高表达，而在K562细胞中几乎不表达，说明特异的bcl2P能引导目的基因在靶细胞表达，可能成为基因定位的一种方法。

　　【关键词】 基因，bcl2; 启动区(遗传学); 流式细胞术; 白血病

　　基因治疗能否取得成功除其有效性之外，能否精确定位到靶细胞并在靶细胞中表达至关重要。应用肿瘤特异性抗原为启动子引导目的基因定位于肿瘤细胞，是肿瘤基因治疗的一条新途径。近年来，已有采用特异性启动子引导目的基因定位于肝癌、乳腺癌和前列腺癌细胞的实验报道。本研究应用pEGFP1质粒构建含有bcl2P的载体，转染高表达bcl2的HL60细胞和低表达bcl2的K562细胞，测定绿荧光蛋白在2种细胞中的表达程度，观察特异性启动子能否引导目的基因在细胞的表达，达到基因定位的目的。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料 酶及试剂 限制性内切酶PstI、BamH I和XBaI,T4DNA连接酶、PCR试剂(美国Promega公司)，限制性内切酶ApaI(美国Pharmacia Biotech公司)。质粒：pEGFP1载体、G418(美国Clontech公司),DH5α感受态细胞(美国Live Technologies公司)，以CaCl2方法制成感受态细胞。在pEGFP1载体多克隆位点(MCS)中PstIApaI位点，插入bcl2 promoter基因编码区，片段长330 bp。

　　1.2 方法

　　1.2.1 克隆bcl2P 从HL60细胞中提取DNA，根据人bcl2P序列(330 bp)设计bcl2P引物(28 bp),其序列为：

　　上游：5’ATGGATCCGGGCCAGGGACGGGCGGAGG3’

　　下游：5’GCTCTAGACGCAGCCCGCTCCGAGCGCT3’

　　用上述引物各5 μL，Taq Buffer 10 μL，Taq酶0.5 μL，在PCR仪(2400型，美国PE公司)扩增，94 ℃ 40 s→63 ℃ 2 min→72 ℃ 2 min，35个循环，72 ℃ 10 min→4 ℃ 10 min。

　　1.2.2 扩增和回收PCR产物 扩增得到的DNA电泳，低融点胶回收，用Gle Extraction Kit(QIAGEX II)提纯。按Promega操作说明插入pBSK载体后转化到DH5α感受态大肠杆菌中，筛选出含bcl2P目的基因质粒的菌落，提取酶切鉴定后，命名为PBSKBCL2P。将所选出的含bcl2P目的基因质粒的大肠杆菌进行测序。用限制性内切酶BamH I和XBaI酶解质粒PBSKBCL2P，电泳，低融点胶回收bcl2P DNA片段，溶于TE中，-20 ℃保存。对扩增的bcl2P DNA进行鉴定后，用酶切的方法把bcl2P DNA拼接到载体pEGFP1(该载体带绿荧光蛋白p基因)多克隆位点(MCS)上，建立pEGFPBCL2p载体，用大肠杆菌扩增pEGFPBCL2P DNA。

　　1.2.3 应用电击法转染pEGFPBCL2P DNA到HL60和K562细胞 收获HL60和K562细胞，用PBS洗涤2次，加入10 μg的pEGFPBCL2P DNA，放在冰水中孵浴5 min后取出，常温下用300 V、500 μF电击，收集细胞在37 ℃、体积分数为0.05的CO2、含有G418的培养液中培养48～72 h。另收集带荧光的细胞进行长期培养。

　　1.2.4 测定pEGFP在HL60细胞和K562细胞中的表达 收获培养后的细胞用PBS洗涤2次，调整细胞数为1×106 mL1，用流式细胞仪测定。用荧光显微镜观测荧光在细胞中的表达程度。

　　2 结 果

　　2.1 目的基因的克隆和测序 以HL60细胞bcl2P基因组DNA为模板，克隆出bcl2P，为330 bp(图1A)。将这段产物插入pEGFP1(图2)载体后，测序结果表明，与GeneBank中序列一样。

　　2.2 启动子报告基因酶切和鉴定 bcl2P与pGFP1经过酶切、连接、转化等步骤后，用限制性内切酶PstI和SacⅡ切割释放出bcl2P的基因片段，证实载体构建成功(图1B)。

　　2.3 电击转染、细胞培养和荧光表达率测定 经电击转染和细胞培养后，收集细胞送流式细胞仪测定。培养48 h后绿荧光的表达率HL60细胞为64.29%(图3A)，显微镜下观测有很强的荧光表达(图4),而在K562细胞中的表达率仅为0.5%(图3B)。表达绿荧光阳性的HL60细胞在培养30 d后仍有89.6%的细胞表达阳性(图3C)，说明bcl2P在HL60细胞中有较稳定的高表达，而在K562细胞中几乎不表达，证明该启动子能引导目的基因在细胞的定位。

　　3 讨 论

　　基因治疗能否取得成功除其有效性之外，能否精确定位到靶细胞并在靶细胞中表达至关重要，特别是恶性肿瘤的基因治疗。应用肿瘤特异性启动子调控序列引导目的基因定位于肿瘤细胞，是实现肿瘤基因靶向治疗的一条新途径[12]。如采用AFP启动子治疗肝癌、DF3/MUCI启动子治疗乳腺癌、ARR2BP治疗前列腺癌的研究，发现这一类的启动子在肿瘤细胞中都获得特异性高表达[34]。本研究根据bcl2在某些肿瘤有高表达的特性[5]，应用bcl2P为引导基因达到了靶向定位的目的。笔者选择高表达bcl2的HL60细胞和低表达bcl2的K562细胞以说明bcl2P的靶向性，实验结果也证实这一点，为今后的临床研究提供实验和数据参考。

　　为什么选择bcl2?因为在研究滤泡性淋巴瘤bcl2基因时发现bcl2是抗凋亡因子，该肿瘤有染色体易位，t(14;18),使bcl2易位到染色体14的免疫球蛋白侧链IgH基因座的旁边，在IgH促进子的作用下，bcl2基因的转录水平提高，使它们容易积A：×40;B：×100.

　　累基因突变，导致细胞转化[67]。随后的研究还发现bcl2除了B细胞淋巴瘤有高表达外，在前列腺癌、结肠癌、乳腺癌等也有高表达，而且与预后不良相关。本研究选择bcl2基因是因为其在B细胞淋巴瘤有高表达，具有很高的特异性。此外，B细胞淋巴瘤是临床最常见淋巴肿瘤，对于今后用于临床研究有更大的意义。

　　人bcl2基因有2个启动子，分别称为启动子1(promoter 1, P1)和启动子2(promoter 2, P2)。在人体大多数细胞中，>95%的bcl2的转录是由P1启动，它位于翻译起始点上游约1.7 kb处，富含能被Sp1结合的GC盒，P1驱动的转录主要从GC盒附近开始，本研究启动子引物的序列设计亦包含了GC盒，成功克隆bcl2P。 笔者用增强的绿荧光蛋白(EGFP)，把绿荧光基因和要表达的bcl2启动子基因连在一起，EGFP很容易识别，只要EGFP表达，bcl2P基因也表达。本研究结果表明，EGFP表达效果良好，表达EGFP的HL60细胞在培养30 d后仍有89.6%的细胞表达，说明这是一种方便和有效的基因定位标记。

　　【参考文献】

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