Caspase8、3蛋白在PUVA诱导K562细胞凋亡时的变化

　　作者：陈楠楠 作者单位：解放军第210医院中医血液科，辽宁大连116021

　　【摘要】 目的研究Caspase8、3蛋白在补骨脂素(PSO)加长波紫外线(UVA)光化学疗法(PUVA)诱导人白血病K562细胞凋亡时的变化。方法用不同浓度的中药补骨脂中提取的PSO和(或)不同照射时间、波长为360nm的UVA作用于K562细胞，检测细胞凋亡率、在电镜下细胞超微结构改变及Caspase8、3蛋白的表达，用多因素方差分析法对定量资料进行统计分析。结果PSO、UVA照射及PUVA均可使细胞凋亡率增加，后两者上调Caspase8、3蛋白的表达，PUVA的作用显著强于前两者;PUVA处理后的K562细胞超微结构出现明显的凋亡形态学改变。结论PUVA可通过激活Caspase8、3基因诱导K562细胞凋亡。

　　【关键词】 光化学疗法 K562细胞 凋亡 Caspase8 Caspase3

　　Changes of Caspase8 and Caspase3 Proteins in K562 Cells during Apoptosis Induced by PUVA

　　Chen Nannan, Liu Xiaoyu, Zhang Li, Xiang Yang, Huang Shilin, Zhang Dejie

　　Department of Traditional Chinese Medicine and Hematology, PLA No.210 Hospital, Dalian116021, China

　　Abstract： ObjectiveTo study the changes of Caspase8 and Caspase3 proteins in K562 cells during apoptosis induced by psoralen (PSO) plus ultraviolet A (UVA) (PUVA). MethodsThe K562 cells were treated with PSO extracted from Chinese medicine psoralea fruits in different concentrations plus UVA (360 nm) in different irradiation time or not. Apoptosis ratios, ultrastructure changes and expression of Caspase8 and Caspase3 proteins were detected. The factorial design and analysis of variance were used to analyze the interaction among the factors. ResultsPSO, UVA and PUVA all increased the apoptosis ratios and UVA and PUVA upregulated the expression of Caspase8 and Caspase3 proteins, but the effects of PUVA were the strongest. There were obvious ultrastructure changes in apoptosis after treatment with PUVA. ConclusionPUVA can induce the apoptosis of K562 cells through activating Caspase8 and Caspase3 genes.

　　Key words： photochemotherapy; K562 cell; apoptosis; Caspase8; Caspase3

　　化疗药物杀伤白血病细胞的主要途径是诱导细胞的凋亡，Caspases(Cysteinyl asparate specific proteinase)是一种特异性蛋白酶，以执行细胞凋亡而受到广泛关注[1~2]。Caspase8和Caspase3均属于该家族的成员，在凋亡过程中发挥重要作用，其中前者被认为是凋亡的启动者，后者被认为是凋亡的执行者[3]。PUVA是补骨脂素(psoralen，PSO)加长波紫外线(Ultraviolet A，UVA)光化学疗法，目前的研究对象多为人工合成PSO衍生物，我们从中药补骨脂中提取了PSO，研究PUVA在诱导人类白血病细胞K562凋亡时Caspase8、Caspase3蛋白的变化，以进一步了解PUVA诱导白血病细胞凋亡的作用机制。

　　1材料与方法

　　1.1细胞株人慢性粒细胞白血病K562细胞由大连医科大学惠赠。常规培养于含10%小牛血清的RPMI1640培养基(含硫酸庆大霉素0.025 U/ml)中，于37 ℃、5%CO2饱和湿度培养箱中进行连续培养。

　　1.2药品及主要试剂

　　补骨脂素由大连理工大学及我院共同由纯中药补骨脂中提取和制备。RPMI1640培养液为Gibco产品。小牛血清系杭州四季青生物材料工程公司产品。HistostainTMPlUs Kits免疫细胞化学分析试剂盒购自美国Zymed公司。DAB(3，3’diaminobenzidine tetrahydrochloride)显色试剂盒购自美国Vector Ltd公司。Caspase8、Caspase 3兔抗人多克隆抗体购自Cell Science公司。

　　1.3仪器和设备

　　流式细胞仪购自美国贝克曼库尔特公司，GLY10型光量子血液平衡治疗仪由徐州华卫医疗设备公司研制。

　　1.4流式细胞术测定

　　PUVA后24 h K562细胞的凋亡情况取浓度为4.0×105/ml，处于对数生长期的K562细胞5 ml，分别加入补骨脂素0，5，10，20，40 μl，使其在反应体系中的终浓度分别为0，10，20，40，80 mg/L，放入石英比色皿中，在GLY10型光量子血液平衡治疗仪(λ=360nm)上以1 J/m2辐射量边照射边震荡，照射时间分别为0 min，5 min。处理后各实验组细胞继续培养24 h 后，收集5.0×105细胞，用PBS洗2次，弃上清，加入100μl碘化丙啶(PI)染液，避光反应30 min，加入PBS 400 μl，上机检测，并用Multicycle软件分析得出相应的细胞凋亡百分率。

　　1.5透射电镜下观察细胞超微结构特点

　　收集浓度为5.0×105/ml，经PUVA处理的K562细胞10 ml，用PBS清洗2次，转入2.0 ml 离心管，离心(2 000 r/min)3 min，弃上清，缓缓加入2.5%戊二醛2 ml，4 ℃ 冰箱静置2 h 以上。磷酸缓冲液冲洗，锇酸固定，水洗、脱水，浸透、包埋，制定超薄切片，透射电镜下观察。

　　1.6免疫细胞化学法(ICC)检测

　　Caspase8、Caspase3蛋白的表达情况细胞处理方法同前，选择PSO浓度为40、80 mg/L，UVA照射时间5 min 组，以及PUVA(PSO 40 mg/L+UVA 5 min)组进行ICC检测。在处理后0、4、8和12 h，以移液器吸取经处理的细胞悬液，注入离心管中离心(1 000 r/min，10 min)，弃上清，加1×PBS (pH7.4)混匀清洗，再离心(1 000 r/min，3 min)，弃上清混匀后均匀涂片，室温吹干，继而用100%冷丙酮-20 ℃ 固定20 min，自然晾干，用于ICC分析。ICC分析方法参照试剂盒说明书，抗体的稀释倍数为1：100，PBS代替一抗为阴性对照。

　　1.7统计学方法

　　所有实验结果均来自至少3组平行实验。采用多因素方差分析法对定量资料进行统计分析;所有统计计算均用SPSS11.5 统计软件进行，P<0.05认为差异有统计学意义。临床军医杂志第36卷

　　2结果

　　2.1PUVA诱导K562细胞凋亡的作用应用流式细胞仪检测PUVA后24 h K562细胞凋亡率，见表1。表1 PUVA 后24 h K562细胞凋亡率(略)

　　2.2透射电镜下观察PUVA后细胞超微结构的改变

　　K562细胞出现细胞体积缩小，胞浆浓缩，胞核体积减小，可裂解成一个或数个致密体，可见核小体碎裂，核染色质聚集或边集，部分染色质致密成斑块状或沿核膜收缩成新月体状，整个细胞可裂解成大小不一凋亡小体。

　　2.3PUVA对Caspase8、Caspase3蛋白的影响

　　应用ICC法检测Caspase8、Caspase3蛋白的表达情况，Caspase8、Caspase3蛋白定位在细胞质或核上，呈棕黄色颗粒。每张涂片随机选取3个视野，计数100个细胞，计算阳性细胞占计数细胞的百分比，见表2、3，封二图4。表2PUVA后K562细胞Caspase8蛋白的表达(略)表3PUVA后K562细胞Caspase3蛋白的表达(略)

　　3讨论

　　过去的研究已经证实PUVA对人类白血病细胞有杀伤作用[4]，在此基础上我们通过流式细胞技术和电镜技术对K562细胞凋亡率及细胞超微结构改变进行了检测和分析，进一步证实PUVA对人类慢性粒细胞白血病K562细胞有明显诱导凋亡的作用，可以说明诱导白血病细胞凋亡是PUVA杀伤人类白血病细胞K562的途径之一。在哺乳动物细胞，Caspase以依赖线粒体和非依赖线粒体两条途径促进细胞凋亡，Caspase8和Caspase3在其中起重要作用。前者是细胞凋亡的启动者，被激活后可引起下游Caspase“瀑布式”激活[5]，且可将凋亡信号从非依赖线粒体途径传递到线粒体途径，把死亡受体通路和线粒体通路联系起来，放大凋亡信号[6];后者是线粒体—细胞色素C途径、死亡配体和(或)受体途径、颗粒酶B途径的共同通路[7~9]，是细胞凋亡的主要效应因子。

　　本组结果显示，单纯PSO对K562细胞Caspase8、Caspase3蛋白的影响较小，两个浓度组间没有统计学差异，未见到随着作用时间的延长而出现的作用增强;UVA及PUVA可使K562细胞Caspase8、Caspase3蛋白的表达增强，对前者的作用PUVA要显著强于UVA，但对后者PUVA与UVA组间没有看到明显的差异，PUVA对两者的作用呈一定的时间依赖性，均在作用8 h 达峰。从研究中我们还发现，PUVA对Caspase8、Caspase3蛋白表达产生明显作用的时间分别为作用8 h 和4 h。理论上，前者是凋亡的启动者，后者是凋亡的执行者，对前者产生影响的时间应该在后者之前，这样的结果或许是因为两者从基因水平转录至蛋白水平所需时间的不同所致。综上所述，我们可以认为诱导细胞凋亡是PUVA杀伤人类白血病细胞K562的途径之一;PUVA在诱导K562细胞凋亡的过程中激活了Caspase8、Caspase3，两者至少需要8 h 才能在蛋白水平上发挥最大作用。

　　【参考文献】

　　[1]Green DR.Apoptotic pathways:the roads to ruin[J].Cell,1998,94(6):695-698.

　　[2]Juo P, Kuo CJ, Reynolds SE, et al. Fas activation of the P38 mitogenactivated protein kinase signalling pathway requires ICE/CED3 family proteases[J].Mol Cell Biol,1997,17(1):24-35.

　　[3]Tong X, Lin S, Fujii M, et al. Molecular mechanisms of echinocystic acidinduced apoptosis　in HepG2 cells[J].Biochem Biophys Res Commun, 2004,321(3):539-546.

　　[4]陈楠楠，黄世林，张德杰，等.补骨脂素加长波紫外线对人白血病细胞株NB4、HL60、K562作用的研究[J].中国中医急症,2007,16(4):444-446.

　　[5]Nagata S. Apoptosis by death factor[J]. Cel1,1997,88(3):355-365.

　　[6]Li H,Zhu H,Xu Q,et al.Cleavage of BID by Caspase 8 mediates the mitochondrial damage in the Fas pathway of apoptosis[J]. Cell,1998,94(4):491-501.

　　[7]Liu X, Kim CN, Yang J, el al. nduction of apoptotic programe in cellfree extracts: requirement for dATP and cytochrome C[J].Cell,1996,86(1):147-157.

　　[8]Nagata S, Goldstein P. The Fas death factor[J].Science,1995,267(5203):1449-1456.

　　[9]Yang X,Stennicke HR,Wang B,el al.Granzyme B mimics apical caspases.Description of a unified pathway for transactivation of executioner caspase3 and7[J]. J Biol Chem,1998,273(51):34278-34283.