系统性红斑狼疮患者骨髓基质细胞因子表达及对免疫功能的影响

　　作者：邹外一 童秀珍 蓝惠霞， 冯炼强， 彭 辉， 尹培达， 罗绍凯 作者单位：中山大学附属第一医院 1. 血液科， 3. 风湿科， 2. 中山大学北校区免疫教研室， 广东 广州 510080

　　【摘要】 【目的】 研究系统性红斑狼疮(SLE)患者骨髓基质细胞因子表达情况，及其对外周血淋巴细胞增殖反应的影响，探讨SLE的发病机制。【方法】 采用ELISA方法观察SLE患者骨髓基质细胞培养液IL-6、MIP-1、IFN-γ、TGF-β等细胞因子的表达，采用四甲基偶氮唑盐比色法(MTT)，观察基质细胞培养上清液对外周血淋巴细胞增殖反应的影响。【结果】 SLE患者骨髓基质细胞培养液IL-6、MIP-1、IFN-γ浓度明显增高，TGF-β则降低，3种细胞因子与SLEDAI评分相关;正常人及SLE患者骨髓基质细胞上清液均对刀豆蛋白A诱导的外周血淋巴细胞增殖有明显的抑制作用，而SLE患者的上清液抑制作用明显低于正常人;在分别加入抗MIP-1、抗IFN-γ单抗后，骨髓基质细胞上清液对外周血淋巴细胞增殖的抑制作用明显增强，而加入抗TGF-β单抗后，抑制作用明显减弱。【结论】 SLE患者骨髓基质细胞对外周血淋巴细胞增殖的抑制作用较弱，与其部分细胞因子异常表达有关，骨髓基质细胞可能与SLE的发病、发展有一定关系。

　　【关键词】 红斑狼疮，系统性; 骨髓，基质细胞; 细胞因子; 淋巴细胞

　　[J SUN Yat-sen Univ(Med Sci), 2007, 28(2):170-174] 系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus, SLE)目前病因尚未完全阐明，一些研究发现部分SLE造血干/祖细胞存在异常[1]，仅此并不能完全解释SLE的发病，引起干/祖细胞异常的机制也未明确。骨髓基质细胞分泌细胞因子除参与造血外也可参与免疫炎性反应，对免疫活性淋巴细胞的前体细胞起重要的作用。除干/祖细胞异常外，SLE患者的骨髓造血微环境是否存在异常?相关文献报道较少。我们采用双抗体夹心ELISA及四甲基偶氮唑盐(3-4,5-dimethylthiazolyl-2,2,5-diphenyl tetrazolium，MTT)比色法，观察SLE患者骨髓造血微环境中的基质细胞培养上清液几种细胞因子的表达情况及其对淋巴细胞增殖反应的影响，探讨SLE患者骨髓微环境是否有助于疾病发展或复发，进一步阐明SLE发病机制，并为探索新的治疗措施提供理论依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 研究对象

　　所有病例来自中山大学附属第一医院2004年3月至2005年4月住院病人，正常骨髓15例，男性2例，女性13例，年龄21～52岁，中位年龄32岁，取自心胸外科患者手术切除的肋骨;原发性血小板减少性紫癜或/和自身免疫性溶血性贫血15例，男性2例，女性13例，年龄17～38岁，中位年龄25岁;SLE 30例均符合美国风湿学会SLE诊断标准[2]，SLE活动指数评分[2](SLEDAI)5～25分，平均12.6分，SLEDAI>9分为活动组，共18例，男性2例，女性16例，年龄13～53岁，中位年龄31岁，SLEDAI 11～25，平均16.1;SLEDAI≤9分为非活动组，共12例，男性2例，女性10例，年龄15～54岁，中位年龄24岁，SLEDAI 5～9，平均7.3。

　　1.2 方 法

　　1.2.1 骨髓单个核细胞的制备 所有病例均取髂前上棘或髂后上棘，用含肝素的注射器抽取骨髓12~15 mL置于含肝素40 U/mL的无菌试管，正常对照组肋骨用咬骨钳挤出骨髓成分，用1640液彻底冲洗骨髓腔，将骨髓细胞收集在灭菌离心管内，反复冲打使骨髓细胞充分分散，加等量1640液稀释，叠加于淋巴细胞分离液上，2 000 r/min(r=15 cm)，离心20 min，吸取单个核细胞层，用1640液洗涤2次，然后配制成骨髓单个核细胞悬液，计数调整细胞数为2×106 cells/mL。

　　1.2.2 骨髓基质细胞层建立 液体培养体系中含200 mL/L胎牛血清， IMDM、青霉素100 U/ mL，链霉素100 U/ mL，氢化可的松10-6 mmol/L，骨髓单个核细胞 5×105 cells/mL，置于6孔培养板中，每孔4 mL，每份样本设置3个复孔，37 ℃、饱和湿度、体积分数5%CO2条件下培养，3 d后弃去全部上清及悬浮细胞，补充等量的上述体系培养液(不含细胞)，之后每周半量换液1次，第3～4周当贴壁细胞铺满约85%～90%培养板底时，吸弃上清，用PBS洗涤2次，加等量上述体系培养液，添加终浓度为5 μg/mL PHA-P刺激，继续培养3～4 d，收集上清，保留待检。

　　1.2.3 骨髓基质细胞培养上清液细胞因子测定 采用固相双抗体夹心ELISA法测定细胞培养上清液白介素-6(Interleukine-6,IL-6)、干细胞因子(Stem cell factor, SCF)、基质细胞衍生因子-1(Stromal cell-derived factor-1, SDF-1)、γ干扰素(Interferon-?酌, IFN-γ)、转化生长因子β(Transforming growth factor β, TGF-β)及巨噬细胞炎症蛋白-1(Macrophage inflammation protein-1, MIP-1)浓度，严格按说明书操作。用Bio-Tek Elx800型酶标仪测定A值。试剂盒标准曲线相关系数在0.99以上。

　　1.2.4 骨髓基质细胞上清液对淋巴细胞增殖的影响 取正常人外周血5 mL，先用等量缓冲液稀释，然后缓慢置于等量的淋巴细胞分离液上，

　　2 000 r/min (r=15 cm)，离心20 min，分离吸取单个核细胞层，用1640液洗涤2次，然后配制成外周血单个核细胞悬液，计数调整细胞数为2×105 /mL。使用96孔培养板，每孔加细胞悬液100μL，并分别加SLE患者或正常人骨髓基质细胞上清液100 μL，对照组则不加上清液，各设3个复孔，每孔加刀豆蛋白A至终质量浓度为2.5 μg/mL， 37 ℃、饱和湿度、体积分数5%CO2培养72 h，各孔加MTT(5 mg/mL)20 μL，继续培养4 h，800 r/min，离心20 min，小心吸弃全部上清液，每孔加二甲基亚砜 100 μL，微量振荡器振荡30 min，使MTT还原产物甲肷完全溶解。酶标仪测定540 nm吸光度。

　　1.2.5 单抗对淋巴细胞增殖的影响 方法同上，SLE患者骨髓基质细胞上清分别加抗IL-6(5 μg/mL)、抗MIP-1 (5 μg/mL)、抗IFN-γ( 5 μg/mL)、抗TGF-β单抗(20 μg/mL)，余步骤同上。

　　1.3 统计学处理 采用SPSS13.0统计软件包处理，计量资料数据以均数±标准差(x±s)表示，两组均数的比较用t检验;多组均数的比较采用单因素方差分析;两变量之间关系采用线性相关分析。

　　2 结 果

　　2.1 SLE患者骨髓基质细胞培养上清液细胞因子测定

　　SLE患者除IL-6高于对照组外(t =3.192, P<0.01)，SCF、SDF-1与对照组无异(分别t =0.611、0.567, P >0.05), 3者在SLE活动组与非活动组则基本相近。原发性血小板减少性紫癜或溶血性贫血患者，SCF高于对照组及SLE组(分别t =2.555、2.287, P< 0.05);负调控因子中SLE患者MIP-1、IFN-γ浓度明显高于对照组(分别t =4.171, 4.527, P< 0.01)，TGF-β则低于对照组(t =3.298, P<0.01)， 3种细胞因子与SLEDAI评分呈线性相关，分别r=0.917、0.818、-0.741，P< 0.01(表1)。

　　2.2 骨髓基质细胞上清对刀豆蛋白A诱导的外周血淋巴细胞增殖的影响：

　　在刀豆蛋白A存在的情况下，外周血淋巴细胞发生显著的增殖效应。但正常人及SLE患者骨髓基质细胞上清液均对刀豆蛋白A诱导的外周血淋巴细胞增殖有明显的抑制作用(分别t =3.999、3.349, P< 0.01);而SLE患者的抑制作用明显低于正常人(t =2.982, P< 0.01);活动期SLE患者的抑制作用低于非活动期患者，但无统计学差异(t =0.560, P >0.05;表2)。

　　2.3 单抗对刀豆蛋白A诱导的外周血淋巴细胞增殖的影响

　　无论正常人骨髓基质细胞上清液，还是SLE患者骨髓基质细胞上清液，在分别加入抗MIP-1、抗IFNγ单抗后，骨髓基质细胞上清液对外周血淋巴细胞增殖的抑制作用明显增强(分别t =3.122、3.950、2.935、3.618, P< 0.01)，加入抗IL-6则无差别不大(分别t =0.472、0.381, P >0.05);而加入抗TGFβ单抗后(分别t =3.505、3.171, P< 0.01)，则抑制作用明显减弱(表3)。

　　3 讨 论

　　骨髓造血微环境由骨髓基质细胞、细胞外基质、黏附分子、基质细胞分泌的各种细胞因子及血管神经等组成[3]。其中以骨髓基质细胞最为重要，它是产生调控造血的细胞因子的主要来源之一，Dormady等[4]检测小鼠骨髓基质细胞培养上清中有多种细胞因子表达。本研究发现SLE患者骨髓基质细胞培养液IL-6、MIP-1、IFN-γ浓度明显增高，TGF-β则降低，3种细胞因子与SLEDAI评分相关，IL-6是多功能细胞因子，参与造血、免疫和炎症反应，是骨髓造血干细胞早期增殖与分化的重要细胞因子，也是T、B淋巴细胞增殖分化以及活化的重要调节因子[5]。在负调控因子方面，TGF-β作为双向造血调控因子，它对各系造血干/祖细胞常常具有负调控作用，与多种细胞因子有拮抗作用，如IFN-γ、TNF-α、IL-1等，而SLE患者上述因子均增加，也可引起TGF-β降低，MIP-1主要对粒系产生抑制。本研究结果与文献报道[6]SLE患者外周血MIP-1、IFN-γ及TGF-β表达改变是一致的，说明这些因子可以反映SLE的活动性，Papadaki等[7]报道认为原发自身免疫病患者骨髓基质细胞以负调控因子，如TNF-α、IFN-γ表达增高为主，而原发性溶血或血小板减少患者以正调控因子如SCF、G-CSF表达增高为主，我们的研究结果则提示SLE患者骨髓基质细胞负调控细胞因子表达异常,而正调控细胞因子中IL-6升高，可能与SLE自身抗体破坏外周血细胞后反应性骨髓代偿增生有关。

　　骨髓基质细胞分泌细胞因子除参与造血外也参与免疫炎性反应，对免疫活性淋巴细胞起重要作用[8]。胚胎期T细胞及B细胞分别在胸腺及骨髓微环境中发育，至表达功能性抗原识别受体阶段，T、B细胞受体分别与微环境基质细胞表面表达的自身抗原肽(主要组织相容性抗原复合物分子及自身抗原)呈高亲合力结合，引发阴性选择，将对自身抗原产生免疫应答的T、B细胞克隆消除。在出生后，T及B细胞仍在发育，对自身抗原应答不成熟的T及B细胞继续施加克隆消除，如果生后胸腺及骨髓微环境基质细胞缺陷，则克隆消除功能障碍，不成熟T、B细胞对自身抗原的应答作用不能消除，导致自身免疫病增加。骨髓基质细胞抑制活化的T淋巴细胞的扩增，这种抑制与基质细胞分泌的可溶性细胞因子有关[9]。也有研究[10]认为基质细胞分泌的细胞因子可以使记忆性T细胞存活，免于凋亡，IFN-γ能诱导吞噬细胞及抗原呈递细胞上调主要组织相容性抗原复合物Ⅱ类分子，增强抗原处理及提呈能力，TGF-β则可抑制免疫应答，TGF-β降低使淋巴细胞激活增加，从而导致致敏T淋巴细胞及多种自身抗体的产生，发生自身免疫反应[11]。总之，自身免疫性疾病患者骨髓造血微环境基质细胞细胞因子分泌缺陷使记忆性T细胞存活并激活，同时对活化的T淋巴细胞扩增抑制缺失或减少，可能导致自身免疫性疾病的发生[12]。

　　我们的实验结果支持上述报道，本研究发现，正常人或SLE患者骨髓基质细胞培养上清液均对刀豆蛋白A诱导的外周血淋巴细胞增殖有抑制作用，而SLE患者的抑制作用低于正常人，活动期SLE患者的抑制作用低于非活动期患者，表明SLE患者骨髓造血微环境缺陷促使淋巴细胞的增殖活化，促进SLE的发生、发展。进一步研究发现，分别加入抗MIP-1、抗IFNγ单抗后，骨髓基质细胞上清液对外周血淋巴细胞增殖的抑制作用明显增强，而加入抗TGFβ单抗后，骨髓基质细胞上清液对外周血淋巴细胞增殖的抑制作用明显减弱，而我们在之前的研究已发现SLE患者造血微环境中MIP-1、IFN-γ是升高的，TGF-β是减低的，提示SLE患者骨髓造血微环境细胞因子异常分泌是导致淋巴细胞存活并激活的重要原因之一，骨髓造血微环境与SLE的发生、发展有着密切的关系。因此，针对SLE患者骨髓基质细胞的干预措施可能有利于疾病的长期缓解。

　　【参考文献】

　　JAYNE D, PASSWEG J, MARMONT A, et al. Autologous stem cell transplantation for systemic lupus erythematosus[J]. Lupus,2004, 13(3): 168-176.

　　童秀珍,李 娟,邹外一, 等.系统性红斑狼疮患者骨髓基质细胞对造血干(祖)细胞的作用[J].中山大学学报：医学科学版,2004,25(2):146-149.

　　MINEHATA K, TAKEUCHI M, HIRABAYASHI K, et al. Oncostatin maintains the hematopoietic microenvironment and retains hematopoietic progenitors in the bone marrow[J]. Int J Hematol, 2006,84(4):319-327.

　　DORMADY S P, BASHAYAN O, DOUGHERTY R, et al. Immortalized multipotential mesenchymal cells and the hematopoietic microenvironment[J]. J Hematother Stem Cell Res, 2001, 10(1): 125-140.

　　FRICK JS, ZAHIR N, MULLER M, et al.Colitogenic and non-colitogenic commensal bacteria differentially trigger DC maturation and Th cell polarization: an important role for IL-6[J]. Eur J Immunol,2006,36(6):1537-1547.

　　ROBAK E, SMOLEWSKI P, WOZNIACKA A, et al. Relationship between peripheral blood dendritic cells and cytokines involved in the pathogenesis of systemic lupus erythematosus[J]. Eur Cytokine Netw, 2004,15(3):222-230.

　　PAPADAKI H A, MARSH J C, ELIOPOULOS G D. Bone marrow stem cells and stromal cells in autoimmune cytopenias[J]. Leuk Lymphoma,2002, 43(4):753-760.

　　吴北燕,黄绍良,陈惠芹, 等.胎肝造血期胎肝间充质干细胞的分离、培养及生物学特性[J].中山大学学报：医学科学版,2005,26(5):498-501.

　　GOTHERSTROM C, RINGDEN O, TAMMIK C, et al. Immunologic properties of human fetal mesenchymal stem cells [J].Am J Obstet gynecol, 2004,190(1):239-245.

　　EL-BADRI N S, MAHESHWARI A, SANBERG PR.Mesenchymal stem cells in autoimmune disease[J]. Stem Cells Dev, 2004,13(5):463-472.

　　KOONPAEW S, SHEN S, FLOWERS L, et al. LAT-mediated signaling in CD4+CD25+ regulatory T cell development[J]. J Exp Med,2006,203(1):119-129.

　　WUFFRAAT N M, DE KLEER I M, PRAKKEN B.Refractory juvenile idiopathic arthritis: using autologous stem cell transplantation as a treatment strategy[J]. Expert Rev Mol Med,2006,8(26):1-11.