TNFR1/RANK嵌合体的构建及其在研究破骨细胞分化中的意义

　　作者：许多荣， 罗绍凯 ， 童秀珍， 李 娟 作者单位：中山大学附属第一医院血液科, 广东 广州 510080

　　【摘要】 【目的】 构建肿瘤坏死因子受体1(TNFR1)膜外部分和核转录因子NF-κB受体激动剂(RANK)跨膜及膜内部分相结合的嵌合体，探讨其在破骨细胞(OC)分化中的意义。【方法】 克隆TNFR1/RANK嵌合体的cDNA，用plat E将其包装成逆转录病毒，通过感染将这种逆转录病毒转染到敲除TNFR1/R2基因的小鼠(TNFR1-/R2-)骨髓巨噬细胞(BMM)中;用TNFɑ刺激，分别观察OC的分化及骨的重吸收能力;用Western Blot方法证实TNFR1/RANK是通过NF-?资B、JNK、P38和ERK蛋白的磷酸化来调节OC的分化和功能。【结果】 在TNFɑ刺激下，BMM能分化成OC，而且分化出的OC能明显地导致骨质破坏。TNFɑ刺激BMM 5 min后磷酸化的NF-?资B、JNK、P38和ERK蛋白的表达明显增强。【结论】 TNFR1/RANK嵌合体具有完整的分子结构和生物功能，可作为研究RANK结构、功能及其信号途径的一个简便、有效的生物工具。

　　【关键词】 TNFR1/RANK; 嵌合体; 破骨细胞; 分化; 克隆

　　破骨细胞(osteoclast, OC)的分化受两个重要细胞因子的调节：单核/巨噬细胞集落刺激因子(monocyte/macrophage-clone stimulating factor，M-CSF)和核转录因子NF-κB受体激动剂的配体(ligand of receptor activator of nuclear factor kappa B, RANKL)。M-CSF主要维持OC的生长，RANKL则促进OC的定向分化[1-3]。RANKL必须与其受体RANK结合，再通过NF-?资B、JNK、P38和ERK蛋白的磷酸化来调节OC的分化和功能[4]，所以RANK是起作用的关键环节。正常的骨髓巨噬细胞(BMM)中存在内源性RANK，但很难直接在机体活细胞内研究其结构和功能。为了克服这一难题，我们成功地构建了一种新的肿瘤坏死因子受体1/核转录因子NF-κB受体激动剂(tumor necrosis factor receptor 1/receptor activator of nuclear factor kappa B,TNFR1/RANK)嵌合体(chimera)，其膜外部分由TNFR1膜外部分组成、膜内部分由RANK跨膜和膜内部分组成，它具有完整的分子结构和生物功能，完全可以替代内源性RANK的作用，现报道如下。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料

　　野生型C3h小鼠购于美国Harlan Industriy in Indianapolis，肿瘤坏死因子受体基因敲除小鼠(TNFR1-/-R2-/-)购于美国the Jackson Laboratory(Bar Harbor, ME);质粒pBluescript SK+、质粒PMX-puro、包装细胞Plat E、M-CSF、GST-RANKL:由美国阿拉巴马大学伯明翰分校(University of Alabama at Birmingham)病理实验室Xu Feng教授提供;抗体IκB-α、Phospho-IκB-α、SAPK/JNK、Phospho-SPAK/JNK、P38 MAP Kinase、Phospho- P38 MAP Kinase、P44/42 MAP kinase、Phospho- P44/42 MAP kinase及磷酸酶抑制剂Ⅰ和磷酸酶抑制剂Ⅱ购于美国Cell Signaling公司。用于扩增TNFR1膜外部分(TNFR1-Ext)的cDNA引物序列为(美国Sigma公司合成)：P1:5′-TCTAGAATGGGTCTCCCCACC GTGCCTGGCCTGCTG-3′;P2:5′-TCTAGAACCT GAGTCCTGGGGGTTTGTGACATTTGC-3′(两端酶切位点均为Xba-Ⅰ)。用于扩增 RANK跨膜、膜内部分(RANK-TM/RANK-Cyt) cDNA引物序列为：P1:5′-TCTAGAATGGGTCTCCCCACCGTGCCTGG CCTGCTG-3′;P2:5′-TCTAGAACCTGAGTCCTGGG GGTT TGTGACATTTGC-3′(P1的5′含Spe-Ⅰ;P2的5′含BamH、stop code和mLu-1)。

　　1.2 方法

　　1.2.1 细胞培养 CH3小鼠、TNFR1-/-R2-/-小鼠的BMM和包装细胞Plat E培养参考[5]。

　　1.2.2 质粒PMX-TNFR1/RANK的克隆 TNFR1/RANK主要由两个部分组成：TNFR1膜外部分(TNFR1-Ext)、RANK跨膜和膜内部分(RANK-TM/RANK-Cyt)。先培养正常小鼠BMM，再从BMM中提取总RNA，用RT-PCR分别获得带有酶切位点的TNFR1-Ext片段和RANK-TM/RANK-Cyt片段。利用Xba-Ⅰ酶切位点将TNFR1-Ext片段克隆到质粒pBluescript SK+上，再用SpeⅠ和BamHⅠ酶切位点将RANK-TM/RANK-Cyt片段克隆到质粒pBluescript SK+上。这样，整个TNFR1/RANK的cDNA就被克隆到质粒pBluescript SK+上。然后再利用NotⅠ和EcoRⅠ切下含TNFR1/RANK 的cDNA并亚克隆到质粒PMX上，最后完成PMX-TNFR1/RANK的构建(图1)。重复实验3次以上，直至所有克隆序列最后都经测序证实是正确无误的。

　　1.2.3 表达PMX-TNFR1/RANK的逆转录病毒的包装 在上述准备好的Plat E细胞培养盘中加入4 μg构建好的质粒PMX-TNFR1/RANK，利用脂质体PlusTM Reagent (Invitrogen Cat No:10964021)、LipofectamineTM Reagent (Invitrogen Cat No:50470)将质粒PMX-TNFR1/RANK转入包装细胞 Plat E中，连续3 d收集含逆转录病毒的细胞培养液，并用直径0.45 μm滤膜过滤备用 [5]。

　　1.2.4 逆转录病毒感染BMM及其感染效率的鉴定 向培养好的BMM培养盘(60 mm × 60 mm)中加入3 mL含病毒悬液、2.4 mL α10培养液、6 μL polybrene(Sigma H-9268, 终浓度为4 μg/mL)和M-CSF(终浓度为10 ng/mL)。第2天用puromycin(Sigma P-7255, 终浓度为24 μg/mL)筛选出病毒感染的阳性细胞。分别收集1×106个未感染(unifected) BMM和感染后的(infected) BMM，作直接免疫荧光标记( Direct Immunofluorescence Labeling)实验[5]以鉴定TNFR1/RANK的逆转录病毒能否感染BMM，以及感染后TNFR1/RANK蛋白能否表达在BMM的细胞膜上。

　　1.2.5 破骨细胞形成实验 将感染和未感染的BMM(5×104)分别加入24孔培养孔中，加入1 mL α10培养液，再分别加入10 ng M-CSF、10 ng M-CSF+100 ng RANKL、10 ng M-CSF+10 ng TNF-а不同组合的细胞因子。每隔2 d更换培养液及各细胞因子1次，观察OC形成并进行TRAP染色[5]。

　　1.2.6 骨重吸收实验 用切片机将鲸鱼牙片制成约0.6 cm × 0.6 cm大小的薄片，放入PBS溶液中高压灭菌后备用。在选择24孔培养板中的培养孔中，每孔加入一块牙片，磷酸缓冲液浸泡2 h后除去缓冲液，然后再向孔中5 × 104个感染后的BMM，并加入10 ng M-CSF、10 ng M-CSF+100 ng RANKL、10 ng M-CSF+10 ng TNF-а不同组合的细胞因子，放入37 ℃、7%的CO2培养箱中，进行培养。每两天更换培养液及细胞因子一次。当OC出现高峰后2~3 d取出骨片，用0.25 mol/L氢氧化氨清除骨片上残留细胞，晾干。液氮下镀金2 h。最后，在电镜下观察骨吸收情况，并摄片[5]。

　　1.2.7 Western 免疫印迹 检测NF-?资B、JNK、P38和ERK蛋白的磷酸化。

　　2 结 果

　　2.1 逆转录病毒感染TNFR1-/-R2-/-小鼠的BMM及其效率的鉴定

　　直接免疫荧光标记实验结果发现：感染后的阳性细胞所携带的荧光明显增强，其峰值明显右移(图2)。这表明嵌合体TNFR1/RAMK蛋白不仅能成功地表达，而且表达在BMM的细胞膜上。

　　2.2 OC 形成实验证实TNFR1/RANK具有诱导OC分化的功能

　　OC 形成实验结果表明：未感染组和感染组BMM单独在M-CSF刺激下不能形成OC;但在M-CSF+RANKL刺激下两组均出现了OC，这正说明了内源性RANK能诱导OC形成;重要的是：在M-CSF+ TNF-ɑ刺激条件下，感染的BMM出现大量的OC，而阴性对照未发现OC，表明这个外源性的TNFR1/RANK嵌合体能诱导BMM分化成OC。

　　2.3 骨吸收实验证实TNFR1/RANK具有调节骨的重吸收功能

　　骨吸收实验结果表明：感染后的BMM不仅能分化成OC，而且分化出的OC具有骨的重吸收能力(图4)。

　　2.4 TNFR1/RANK通过NF-kB、JNK、P38和ERK蛋白的磷酸化调节OC的分化和功能

　　在本实验中，我们用RANKL刺激感染后细胞(Uninfected BMM)作为阳性对照组、TNF-α刺激未感染细胞(Uninfected BMM)作为阴性对照组，然后用TNF-α刺激感染后细胞作为观察组进行western blot实验，观察IкB、JNK、ERK、P38蛋白磷酸化的情况(图5)。结果证实：在阴性对照组中，p-IкB、p-JNK、p-ERK、 p-P38在0、5、10 min无变化趋势。重要的是观察组和阳性对照组一样，在受刺激5 min后，磷酸化的蛋白明显升高。这表明：TNFR1/RANK嵌合体中的外源性RANK和内源性RANK一样，也能激活I?资B、JNK、ERK、P38蛋白的磷酸化。

　　3 讨 论

　　3.1 在BMM中构建TNFR1/RANK嵌合体的重要性

　　RANK主要分布在骨髓巨噬细胞、激活的T淋巴细胞表面，在肾性骨病[6]、风湿性关节炎和多种恶性肿瘤的骨损害[7-8]方面起着重要的作用。要想知道RANK在OC生成、激活和分化中的作用，首先必须清楚RANK具有功能的结构部分。由于BMM存在内源性RANK的干扰，往往给我们研究其结构和功能带来很大困难。为了排除这种干扰，我们设计了TNFR1/RANK这个嵌合体，当它被转染到TNFR1/TNFR2基因敲除小鼠的BMM中后，再用TNF-a刺激，其本身内源性的RANK就不再起作用，起作用的是TNFR1/RANK chimera这个外源性RANK。在分子生物学的研究中，改变一个外源性基因的结构通常比改变其内源性基因结构更为容易、简便。因此，我们根据实验的需要，通过改变这个外源性RANK的结构，然后将其感染到BMM中，再观察其功能，就可很容易找出RANK具有功能的结构部分及其在OC分化中的传导途径。另外，近年来多位学者[9-10]对RANK和TRAF之间的关系作了很多研究，但他们之间的结果存在很大的争议，究其原因发现他们的研究大多在293、Hela等细胞系或酵母菌中进行，这些细胞或细菌本身不能分化成OC，和生理条件相差很远。我们在能分化成OC的BMM中研究RANK信号传导，模拟更接近生理环境，得出更准确结论。

　　3.2 构建的TNFR1/RANK chimera结构和功能的正确性

　　在TNFR1/RANK chimera构建的过程中，所有的克隆都经测序证实其cDNA序列是完全正确的。直接免疫荧光标记法也证实了TNFR1/RANK蛋白能成功表达在BMM细胞膜上，用TNF-ɑ和M-CSF刺激表达TNFR1/RANK的BMM，不仅诱导出了OC，而且证实这些OC和内源性的OC具有相同的吸收骨的能力。同时，我们还证实：TNFR1/RANK嵌合体中的外源性RANK也和内源性RANK一样，通过I?资B、JNK、ERK、P38蛋白的磷酸化调节OC的分化和功能。所以，我们构建的TNFR1/RANK chimera具有完整的结构和功能，可为研究RANK在OC形成、分化及其信号传导中的作用提供一个有效的生物工具。

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