肝细胞生长因子对异基因骨髓移植小鼠血清TNFα、IFNγ、IL4水平的影响

　　作者：夏云金 万楚成, 程范军,高清平,郭仁慈 作者单位：郧阳医学院 1附属太和医院血液科;2附属东风医院血液科，湖北 十堰 442000

　　【摘要】 目的：探讨肝细胞生长因子(HGF)对小鼠异基因骨髓移植(alloBMT)后血清TNFα、IFNγ、IL4的影响。方法：BALB/c小鼠接受60钴11Gy全身照射，将昆明小鼠骨髓移植给该BALB/c小鼠。随机将BALB/c小鼠分A、B两组，A组移植后0~7 d皮下注射HGF，B组皮下注射PBS，移植后第8天取血检测TNFα、IFNγ和IL4水平。结果：A组的TNFα、IFNγ均低于B组(P<0.01);A组的IL4高于B组(P<0.05)。结论：HGF对小鼠alloBMT后的细胞因子失衡具有调节作用。

　　【关键词】 肝细胞生长因子

　　The effect of hepatocyte growth factor on the level of TNFα、IFNγ、IL4 in serum after allogenic bone marrow transplantation in mice XIA Yun-jin, WAN Chu-cheng, CHENG Fan-jun,et al. (Depatment of Hematology, Taihe Hospital， Yunyang Medical College, Shiyan,Hubei 442000)

　　Abstract:Objective To investigate the effect of hepatocyte growth factor (HGF) on the level of TNFα, IFNγ and IL4 in serum after allogeneic bone marrow transplantation(alloBMT)in mice. Methods Transplantation of bone marrow of kunming mice to BALB/c mice which were conditioned with 11Gy lethal total body irradiation. BALB/c mice were divided into group A and B, group A were injected subcutaneously with HGF and group B with PBS from day 0 to 7 after alloBMT.The level of TNFα, IFNγand IL4 were determined by ELISA. Results the levels of TNFα and IFNγ in group A was lower than that in group B (P<0.01); the levels of IL4 in group A was higher than that in group B (P<0.05).Conclusion HGF can adjust the dysregulation of cytokine in serum after alloBMT in mice.

　　Key words: hepatocyte growth factor; Tumor Necrosis Factorα; Interferonγ; Interleukin4

　　异基因骨髓移植(allogeneic bone marrow transplatation,alloBMT)最常见的并发症是急性移植物抗宿主病(aGVHD)。aGVHD主要表现为造血功能衰竭、免疫功能低下及皮肤、肝脏和肠粘膜等组织损害，危及生命。为防治GVHD，多数治疗方案是清除供者T细胞或应用非特异性免疫抑制药物，但这将影响骨髓植入和免疫功能重建。aGVHD的组织损伤是由供者T细胞识别宿主细胞表面抗原，介导细胞毒作用引起。预处理引起的细胞因子分泌失衡、胃肠道粘膜上皮细胞损伤，使细菌的降解产物如脂多糖(LPS)进入血液，引发“细胞因子风暴”，进一步活化T细胞及致靶器官的各种病理损害，对炎性细胞因子的调节是防治aGVHD的重要措施[1]。为了探讨肝细胞生长因子(HGF)对alloBMT后炎性细胞因子的影响，我们观察了HGF对小鼠alloBMT后血清细胞因子肿瘤坏死因子(TNFα)、干扰素(IFNγ); 白细胞介素4(IL4 )的调节作用。

　　1材料与方法

　　1.1 实验动物骨髓移植供鼠为昆明小鼠16只，雌性7~9周龄，18~22 g，购自郧阳医学院实验动物中心。骨髓移植受鼠为BALB/c小鼠16只，雄性8~9周龄，16.5~22 g，均购自湖北省实验动物研究中心，为无特定病原体的动物(specific pathogen free animal,SPF)。小鼠饲养在DJ系列动物洁净饲养柜中(苏州长桥净化设备厂生产)。实验操作在超净工作台中进行。

　　1.2药物、试剂与设备

　　肝细胞生长因子(批号0310048)，TNFα、IL4与IFNγ的ELISA检测试剂盒均购自深圳晶美生物工程有限公司(批号分别为FMK0008-96、FMK0005-96 与FMK0003-96)。二氧化碳培养箱(日本Sanyo产MCO-15AC型)，酶标仪(芬兰产Wellscan MK3型)。

　　1.3受鼠饲养与放疗

　　BABL/c受鼠饮用含庆大霉素(32×104u/L)和红霉素(250 mg/L)的灭菌水，饲料经紫外线照射后放进层流架中。用60钴全身照射(TBI)BABL/c小鼠，总剂量11 Gy，共18 min，TBI后即在动物洁净饲养柜中饲养，4~5 h后行alloBMT。

　　1.4骨髓移植

　　常规取昆明小鼠大腿骨髓制成单个核细胞悬液，0.83%氯化氨溶液溶解红细胞，RPMI1640洗2次后，调整细胞数为2×108/ml，每只BALB/c小鼠尾静脉输注单个核细胞悬液约0.2 ml。

　　1.5实验分组

　　根据随机化的原则将16只BABL/c鼠等分为两组，A组为BABL/c小鼠实验组;B组为BABL/c小鼠对照组。A在移植第0天到移植后7 d皮下注射肝细胞生长因子200 μg/kg，一天一次，B组皮下注射PBS。

　　1.6TNFα、IFNγ与IL4测定

　　骨髓移植后8 d，取A、B两组BABL/c小鼠血标本分离血清，严格按照TNFα、IFNγ与IL4的双抗体夹心ELASA检测试剂盒操作说明进行TNFα、IFNγ与IL4的检测。

　　1.7统计学分析本组所测资料均以x±s表示，采用t检验。

　　2结果

　　肝细胞生长因子对A、B两组血清TNFα、IFNγ、IL4水平的影响详见表1。

　　3讨论

　　目前认为发生aGVHD有三个步骤：①alloBMT前超大剂量放、化疗的预处理等引起宿主内皮细胞、上皮细胞及巨噬细胞释放炎性细胞因子如IL1、IL6、TNFα、自然杀伤细胞刺激因子等，使皮肤、胃肠粘膜、肝脏等靶器官的组织细胞上的组织相容性蛋白及细胞粘附分子(如整合素等)表达增加，增强供者T细胞对宿主MHC抗原的识别，同时由于胃肠道粘膜上皮细胞损伤，使细菌的降解产物如脂多糖(LPS)大量进入血液，刺激宿主体内的巨噬细胞产生IL12[2] 。②IL12刺激供者骨髓中T细胞增殖，供、受者MHCⅡ类抗原不合引起CD4+T细胞增殖，MHCⅠ类抗原不合引起CD8+T细胞增殖。由CD4+Th1细胞分泌Ⅰ类细胞因子IL2、TNFα、IFNγ等，由CD4+Th2细胞分泌Ⅱ类细胞因子IL4、IL5、IL6、IL10等，Ⅰ类细胞因子IFNγ等促进aGVHD的发生，而Ⅱ类细胞因子IL4、IL10等抑制IFNγ的分泌，减轻aGVHD严重性[3]。但主要是供者T细胞被极化为CD4+Th1细胞，并分泌IL2、IFNγ，IL2、IFNγ使T细胞进一步增殖，使细胞毒性T细胞(CTL)、NK细胞反应性增高。③LPS、IL2及IFNγ等激活供者单核细胞产生更大量的炎性细胞因子如IL1、TNFα、IL6、IFNγ等，引起细胞因子瀑布式爆发，Ⅰ类细胞因子与Ⅱ类细胞因子失衡，Ⅰ类细胞因子过度产生，直接导致靶器官的各种病理损害。另外，被IL2及IFNγ激活的CTL和NK细胞也会造成细胞损伤，IL2及IFNγ还可直接引起皮肤和肠道的损害。因此，预处理、感染等引起的细胞因子分泌失衡，胃肠道粘膜上皮细胞损伤使细菌的降解产物如LPS进入血液，引发“细胞因子风暴”，是aGVHD致靶器官的各种病理损害的重要原因之一。若对胃肠道粘膜予以保护，可减少LPS进入血液循环，使alloBMT后炎性细胞因子的产生减少，Ⅰ类细胞因子与Ⅱ类细胞因子的产生趋于平衡，从而减轻GVHD[1]。

　　HGF是由分布于全身各组织器官中的间质细胞产生的具有多种生物学活性的细胞因子，不同种属的HGF具有高度同源性。原癌基因cmet编码的蛋白是HGF的主要受体，HGF可与cmet快速、特异性、高亲和度地结合，导致细胞分裂或分化增加。HGF及其受体cmet蛋白都存在于肝、小肠等组织器官中[4]。HGF可以促进上皮组织、肝、肾、肺、肠道细胞等有丝分裂作用及抗凋亡活性，对许多组织细胞包括肝、肾、肺、肠道粘膜上皮细胞、内皮细胞及造血细胞等的生长、分化起重要调控作用，在组织修复中具有重要作用[5]。HGF能促进肝细胞增生，已广泛用于肝脏损伤后肝细胞再生的治疗。实验证实HGF能促进培养的小肠上皮细胞的数量增加和功能增强，HGF对移植肠粘膜结构的维护作用可能和HGF与其受体结合后导致复杂的细胞内信号传递有关[6]。我们对alloBMT小鼠短期应用HGF治疗，发现HGF可以使与aGVHD导致组织器官损害密切相关的TNFα水平下降。IFNγ与IL4分别是Th1和Th2类代表性细胞因子[7]。在移植后第8天检测了小鼠血浆的IFNγ与IL4水平，发现HGF对alloBMT小鼠有下调IFNγ、上调IL4的作用，即HGF通过调节Th1/Th2类细胞因子水平，使之趋于平衡。可见，HGF对小鼠alloBMT后的细胞因子失衡具有调节作用，HGF降低IFNγ的水平，可抑制T细胞的活化及增殖;HGF促进肠粘膜细胞的修复，可降低血清内毒素的水平，从而抑制抗原提呈过程;HGF抑制细胞因子如TNFα的释放，从而抑制GVHD的效应阶段，即HGF可从多个环节减轻aGVHD的严重程度。

　　【参考文献】

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　　[2] Welniak LA, Blazar BR, Wiltrout RH, et al. Role of interleukin-12 in acute graft-versus-host disease[J].Transplant Proc. 2001,33(1-2):1 752-1 753.

　　[3] Ferrara JL. The cytokine modulation of acute graft-versus-host disease[J]. Bone Marrow Transplant.1998,21,3:13-15.

　　[4] Sonnenberg E,Meyer D,Weidner KM,et al.Scatter factor/hepatocyte growth factor and its receptor, the c-met tyrosine kinase, can mediate a signal exchange between mesenchyme and epithelia during mouse development[J].J Cell Biol,1993,123(1):223-235.

　　[5] Kuenzler KA, Arthur LG, Schwartz MZ. A possible mechanism for prevention of intestinal programmed cell death after ischemia reperfusion injury by hepatocyte growth factor pretreatment[J]. J Pediatr Surg,2002,37(12):1 696-1 699.

　　[6] Fukamachi H, Ichinose M, Tsukada S, et al.Hepatocyte growth factor region specifically stimulates gastro-intestinal epithelial growth in primary culture[J].Biochem Biophys Res Commun, 1994,205(2): 1445-1451.

　　[7] 邢同京,章 廉主编.Th类细胞极化群体的基础与临床[M].北京:军事医学科学出版社,2002.11.