血小板膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa受体拮抗剂RGDS对血小板释放反应的影响

　　作者：谢双锋，尹松梅，杨国雷，聂大年，李益清，王秀菊，马丽萍，吴裕丹 王景峰 作者单位：中山大学附属第二医院，1血液内科， 2心血管科， 广东 广州 510120

　　【摘要】 【目的】 观察血小板膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa(GPⅡb/Ⅲa)拮抗剂——四肽Arg-Gly-Asp-Ser(RGDS)对血小板聚集和CD62p表达的作用，探讨RGDS对血小板聚集和释放反应的影响。【方法】 检测二磷酸腺苷(ADP;终浓度5 μmol/L，下同)诱导血小板聚集的最大聚集率(rPA, max)、静息血小板和ADP诱导的血小板CD62p表达，检测不同浓度RGDS对ADP诱导的rPA, max的抑制率和血小板CD62p表达的抑制率，进行回归分析。【结果】 5种浓度(50、100、200、400、800 μmol/L)的RGDS对rPA, max均有显著抑制作用。正常人静息血小板CD62p表达率为(3.5±0.6)%;ADP激动的血小板CD62p表达率为(65.6±13.8)%，两组比较有显著性差异(P<0.01);50、100 μmol/L的RGDS对血小板CD62p表达无抑制作用;当RGDS浓度≥200 μmol/L时(200、400、800 μmol/L)，其可抑制血小板CD62p的表达;RGDS对rPA, max的抑制作用和其对血小板CD62p表达的抑制作用相关。【结论】 RGDS浓度<200 μmol/L时，对ADP诱导的血小板释放反应无影响;RGDS浓度≥200 μmol/L时，可抑制ADP诱导的血小板释放反应;与RGDS显著的抗聚集效应相比，其对血小板释放反应的影响比较小;RGDS抑制血小板释放反应的作用与其抗血小板聚集有关。

　　【关键词】 血小板膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa; 受体拮抗剂RGDS; CD62p

　　[J SUN Yat-sen Univ(Med Sci), 2007, 28(2):192-195] 基础和临床实验均证明了血小板膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa(Glycoprotein Ⅱb/Ⅲa, GPⅡb/Ⅲa)受体拮抗剂强大的抗血小板聚集作用[1]，但其对血小板释放反应的作用尚不明确，相关研究无统一结论。我们通过观察不同浓度的GP Ⅱb/Ⅲa受体拮抗剂——四肽Arg-Gly-Asp-Ser (RGDS) 对血小板聚集和CD62p表达的影响，探讨GP Ⅱb/Ⅲa受体拮抗剂RGDS对血小板释放反应的影响。

　　1 材料与方法

　　1.1 标本来源

　　2006年1月-2006年10月于我院体检中心体检的健康者15人，20～40岁，性别不限，近1个月无用药史;排除冠心病、高血压、糖尿病患者及妊娠女性。空腹12 h后肘静脉采血，柠檬酸葡萄糖液(acid citrate dextrose, ACD)抗凝，抗凝液与血液体积比例为1：6。

　　1.2 实验方法

　　1.2.1 血小板最大聚集率(maximal platelet aggregation, rPA, max)的测定 ACD抗凝静脉血，150 g离心8 min，吸取富血小板血浆，再以650 g离心10 min;弃去上清液，加入含1 g/L的牛血清白蛋白的羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)缓冲液吹散沉淀，调整血小板数于(200～300)×109/L，每次测试取190 μL，加入诱导剂二磷酸腺苷(ADP)(二磷酸腺苷购自美国Sigma-Aldrich公司，本文中ADP终浓度均为5 μmol/L);在TYXN-91智能血液凝集仪(上海通用机电技术研究所产品)连续测量并记录血小板聚集5 min， 以rPA, max为观察指标[12]。

　　1.2.2 血小板膜糖蛋白CD62p测定 ACD 抗凝静脉血，分成每份90 μL，加入ADP孵育5 min，实验组加入CD62p:PE、CD61:PerCP，对照组对应加入Mouse IgG:PE、CD61:PerCP染色，室温下作用20 min，立即加入2～8 ℃的甲醛溶液1 mL，置2～8 ℃冰箱内固定30 min，24 h内上机检测;每次检测取5 μL标本，以CD61:PerCP和SSC双参数设门，检测CD62p阳性血小板的百分率。

　　1.2.3 RGDS对rPA, max作用 制备处理标本同1.2.1 加入诱聚剂ADP之前，先加入不同浓度的RGDS于37℃孵育2 min，其余各步骤相同。rPA, max抑制率=[(对照组rPA, max-RGDS用药后rPA, max)/对照组rPA, max]×100%。

　　1.2.4 RGDS对血小板CD62p表达率的作用 制备处理标本同1.2.2，静息组不加ADP直接测定，对照组加入ADP，RGDS用药组加入不同浓度的RGDS于37℃孵育10 min后加入ADP;其余各步骤相同。CD62p表达抑制率=[(对照组CD62p表达率-RGDS用药后CD62p表达率)/对照组CD62p表达率]×100%。

　　1.3 统计分析

　　采用统计软件SPSS 11.0进行数据分析，正常人静息状态下和ADP激动后血小板CD62p表达的比较采用随机化配对设计资料均数的t检验;各浓度RGDS孵育前后的比较采用随机化配对设计资料均数的t检验;不同浓度RGDS和其对rPA, max和CD62p的抑制率关系采用等级相关分析;采用回归分析确定RGDS对rPA, max和血小板CD62p表达率的量效关系。

　　2 结 果

　　2.1 ADP诱导的血小板活化及释放反应

　　正常人(n=15)静息状态下血小板CD62p表达率为(3.5±0.6)%;ADP激动后血小板活化并发生释放反应，血小板CD62p表达率明显增高到(65.6±13.8)%(与静息状态比较，P=0.000);正常人(n=15)ADP诱导的rPA, max为(82.4±6.5)%。

　　2.2 RGDS对血小板rPA, max和CD62p表达率的作用

　　实验中采用的5种浓度下，RGDS对rPA, max均有抑制作用，随着RGDS浓度的增加，抑制作用增强，RGDS能以浓度依赖性的方式抑制rPA, max，RGDS的浓度和其对rPA, max抑制率之间存在正相关(r=1，P=0.000)，根据回归方程，RGDS对rPA, max抑制的IC50值为257 μmol/L(95%可信区间211 μmol/L～312 μmol/L)。实验中采用5种RGDS浓度中，当RGDS浓度≥200 μmol/L时，其抑制血小板CD62p表达的作用有统计学意义，RGDS的浓度和其对CD62p抑制率之间存在正相关(r=1，P=0.000)，实验采用最高浓度RGDS时，其对CD62p的抑制仍未达到IC50(表1)。

　　2.3 RGDS对血小板rPA, max和CD62p表达率作用的关系

　　不同浓度RGDS作用时rPA, max和血小板CD62p表达抑制率呈正相关(r=1，P=0.000);根据回归方程，当RGDS对rPA, max抑制率达到IC50时，其对CD62p表达抑制率的95%可信区间为12%~18%。

　　3 讨 论

　　血小板活化在血栓形成中起重要作用。血小板活化包括3个方面：黏附、聚集和释放;三者相互促进，形成的血小板血栓是血栓形成的始动环节;血小板功能研究是血栓性疾病防治的重点。血小板胞浆颗粒和血小板膜糖蛋白参与血小板活化，血小板胞浆颗粒主要有致密颗粒和α颗粒，CD62p是一种炎症反应的标志物，是细胞黏附分子选择素成员之一，主要分布于静息血小板的α颗粒中，CD62p在静息血小板上表达量很低;当受到缺氧、自由基、凝血酶、ADP等的刺激后，发生脱颗粒反应，颗粒膜与细胞膜融合，使CD62p表达到血小板膜上，介导白细胞和内皮细胞的起始黏附，在炎症反应和血栓形成中起着中心环节作用[3，4]。既往研究表明，降低高胆固醇血症患者血小板CD62p表达，可能是他汀类降脂药物促进动脉粥样斑块消退的机制之一[5]。

　　血小板膜GP Ⅱb/Ⅲa作为纤维蛋白原受体，介导血小板聚集的最终途径，在血小板黏附、聚集中起重要作用。血小板聚集产生的“外向内”信号转导，进一步促进血小板释放。GP Ⅱb/Ⅲa受体拮抗剂抗血小板聚集的同时，对血小板释放反应的影响报道不一。Ogawa[6]试验发现，在搅拌条件下，GP Ⅱb/Ⅲa受体拮抗剂奥波非班的活性代谢产物SC-57101A能浓度依赖的抑制ADP与胶原诱导的血小板PF4与β-TG的释放，并且认为这种作用是通过抑制聚集依赖性血栓素A2实现的;在不搅拌的条件下，SC-57101A能抑制血小板CD62p表达，虽然抑制率小但有统计学意义。Carroll[7]报告GP Ⅱb/Ⅲa受体拮抗剂能抑制ADP诱导的血栓素A2的合成，但机制不明确。Divid[8]研究发现阿昔单抗和依替菲巴肽能够使ADP诱导的CD62p表达短暂升高，然而奥波非班对CD62p表达无影响。UteKlinkhard[9]指出，阿昔单抗浓度小于0.5 mg/L时能够使ADP诱导的ATP释放增加。以往作者的研究观察了多种GP Ⅱb/Ⅲa受体拮抗剂对血小板释放的作用，多数结论提示GP Ⅱb/Ⅲa受体拮抗剂可轻度抑制或不改变血小板释放反应，与我们的研究结论一致。

　　我们以CD62p表达率反映血小板的释放，采用由低到高5个不同浓度的RGDS，观察其对5 μmol/L ADP诱导的血小板CD62p表达的作用。发现当RGDS的浓度大于200 μmol/L时，其抑制血小板CD62p表达的作用有统计学意义，与其相同浓度对rPA, max的抑制率比较，RGDS对血小板CD62p表达的抑制率比较小，800 μmol/L RGDS对血小板CD62p抑制率仅为29%左右;浓度小于200 μmol/L的RGDS对血小板CD62p表达的抑制作用无统计学意义。低浓度的RGDS对ADP诱导的血小板释放反应无影响，说明RGDS对血小板聚集与释放反应的抑制作用不一致，与RGDS显著的抗聚集效应相比，RGDS对ADP诱导的血小板释放反应的抑制作用较小。RGDS对血小板聚集、CD62p表达率的作用相关分析表明两者之间呈正相关，提示RGDS对血小板释放反应的作用与其抗血小板聚集有关。血小板GP Ⅱb/Ⅲa受体“外向内”信号传递引起血小板的第2次活化反应，促进α颗粒与致密颗粒的释放，使更多的血小板聚集[10]。RGDS通过抗血小板聚集，减少了“外向内”信号转导，从而减少了血小板α颗粒的释放;而RGDS对ADP诱导的血小板释放反应的影响较小，提示诱导血小板α颗粒的释放反应可能存在多种途径，激动GP Ⅱb/Ⅲa受体产生“外向内”信号只是其中之一。所以在我们实验观察中，GP Ⅱb/Ⅲa受体拮抗剂只能部分减少ADP诱导的血小板的释放反应。临床上GP Ⅱb/Ⅲa受体拮抗剂单独应用虽然可以发挥强大的抗血小板聚集作用，但单独应用的临床效果并不理想。目前推荐GP Ⅱb/Ⅲa受体拮抗剂和其他抗凝、抗血小板药物共同使用，联用其他药物除抗血小板聚集的作用外，可能有共同减少血小板释放作用，更好的改善血栓性疾病的预后。

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