肾上腺素与rhG-CSF协同动员小鼠造血干祖细胞的研究

　　作者：李勇，曾令宇，陈翀，曹江，潘秀英，徐开林 作者单位：江苏省“六大人才高峰”项目资助(06-B-29) 徐州医学院附属医院血液科，江苏徐州221002

　　【摘要】 目的 通过比较肾上腺素和重组人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)单独或联合应用动员小鼠外周血造血干祖细胞(HSPC)的效果，以了解肾上腺素对HSPC的动员作用，为临床制定更为优良的动员方案奠定实验方面的基础。方法 BALB/c小鼠48只，随机分成4组，每组12只。A组作为对照组，皮下注射生理盐水(NS) 100 μl·d-1;B组皮下注射rhG-CSF 250 μg·kg-1·d-1;C组腹腔注射肾上腺素2.5 mg·kg-1·d-1;D组皮下注射rhG-CSF 250 μg·kg-1·d-1+腹腔注射肾上腺素2.5 mg·kg-1·d-1 (rhG-CSF后3 h),各组均连续用药5天。动态观察各组小鼠外周血中白细胞数(WBC)、Lin-c-kit+ (KL)、Lin-c-kit+Sca-1+ (KSL)细胞比例的变化。结果 D组外周血WBC数及KL、KSL细胞比例明显高于B组(P<0.05)或C组及A组(P<0.01);B组外周血WBC数及KL、KSL细胞比例明显高于C组及A组(P<0.01);C组外周血WBC数明显高于A组(P<0.01)，但KL、KSL细胞比例与A组比较无显著性差异(P>0.05)。结论 肾上腺素可协同rhG-CSF参与HSPC的动员。

　　【关键词】 造血干祖细胞;肾上腺素;重组人粒细胞集落刺激因子;KL细胞;KSL细胞

　　Effects of epinephrine in combination with rhG-CSF on mobilizing hematopoietic stem and progenitor cells in mice

　　LI Yong, ZENG Lingyu, CHEN Chong, CAO Jiang, PAN Xiuying, XU Kailin*

　　(Department of Hematology, Affiliated Hospital of Xuzhou Medical College, Xuzhou, Jiangsu 221002, China)

　　Abstract: Objective To investigate the mobilizing effect of epinephrine on HSPC by comparative study on the effects of epinephrine and recombinant human granulocyte colony stimulating factor (rhG-CSF) when used alone or in sequential combination in mobilizing hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) in mice and optimize the strategy of mobilization. Methods 48 BALB/c mice were randomly divided into 4 groups, with 12 mice in each group. In Group A (the control group), each mice was given a subcutaneous injection of NS 100 μl·d-1; in Group B, each mice was subcutaneously injected with rhG-CSF 250 μg·kg-1·d-1 alone; in Group C, each mice was intraperitoneally injected with epinephrine 2.5 mg·kg-1·d-1 alone; in Group D, each mice was injected in sequential combination of rhG-CSF 250 μg·kg-1·d-1 subcutaneously and epinephrine 2.5 mg·kg-1·d-1 intraperitoneally 3 h after rhG-CSF. All the groups were injected for five consecutive days. Variations of the white blood cell (WBC) count, and the proportions of KL and KSL cells in peripheral blood of mice were dynamically observed. Results The WBC count, and the proportions of KL and KSL cells in peripheral blood of Group D were all markedly higher than those of Group B (P<0.05) and Group C or Group A (P<0.01); Group B mobilized more WBC, KL and KSL cells in peripheral blood as compared to those of Group C and Group A (P<0.01); Group C had much more yield of WBC than that of Group A (P<0.01), while the proportions of KL and KSL cells had no significant difference (P>0.05). Conclusion Epinephrine can participate in mobilizing HSPC in coordination with rhG-CSF.

　　Key words: hematopoietic stem and progenitor cells; epinephrine; recombinant human granulocyte colony stimulating factor; KL cells; KSL cells

　　造血干祖细胞(hematopoietic stem and progenitor cells, HSPCs)大多数定植于骨髓内，是造血系统中原始的细胞群体，造血干细胞(hematopoietic stem cells, HSCs)是HSPC群体中更为原始的部分。HSPC特别是HSC具有很强的增殖分化能力，可被动员至外周血用于造血干细胞移植重建造血。外周血造血干细胞移植(peripheral blood hematopoietic stem cell transplantation, PBHSCT)需要动员剂使外周血有足够数量的HSPC才能保证移植成功[1]。目前临床常用动员剂是重组人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)、重组人粒-巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)，近年报道肾上腺素可对HSPC的动员产生影响[2-4]，但肾上腺素与刺激因子联合能否增加外周血HSPC的数量，国内外文献鲜见报道。因此, 我们采取肾上腺素、rhG-CSF单用或联合应用对小鼠HSPC进行动员并比较动员效果,旨在了解肾上腺素的动员作用,为临床制定更为优良的动员方案提供实验方面的基础。

　　1 材料和方法

　　1.1 实验动物 BALB/c小鼠48只，雌雄各半，体重18～22 g，10～14周龄，清洁级近交系小鼠，购自扬州大学实验动物中心，按清洁级标准饲养。

　　1.2 主要药品试剂和仪器 rhG-CSF购自杭州九源基因工程有限公司;PerCP-CY5.5-anti mouse CD45、APC-anti mouse Sca-1、PE-anti mouse c-kit、造血细胞谱系混合标记FITC-Lin (包括anti mouse CD45R/B220、anti mouse Mac-1、anti mouse Gr-1、anti mouse CD4、anti mouse CD8、anti mouse Tre119)等单抗购自Biolegend公司;流式细胞仪(FACS Calibur)由BD Biosciences公司生产。

　　1.3 分组与给药方法 BALB/c小鼠48只，随机分成4组，每组12只。A组作为对照组：皮下注射生理盐水100 μl·d-1(早7时);B组：皮下注射rhG-CSF 250 μg·kg-1·d-1(分两次：早7时、晚7时);C组：腹腔注射肾上腺素2.5 mg·kg-1·d-1(早10时);D组：皮下注射rhG-CSF 250 μg·kg-1·d-1(分两次：早7时、晚7时)+腹腔注射肾上腺素2.5 mg·kg-1·d-1(早10时)，各组均连续用药5天。

　　1.4 检测指标

　　1.4.1 外周血WBC计数 于给药前(d0)、给药后1～5天(d1～d5)及停药后1天(d6)每天早11时取小鼠尾静脉血2 μl，加入2%稀醋酸中，混匀后利用细胞计数板在显微镜下进行WBC计数。

　　1.4.2 外周血Lin-c-kit+(KL)、Lin-c-kit+Sca-1+(KSL)细胞比例检测 于d0～d6每天早11时取小鼠尾静脉血50 μl，加入PerCP-CY5.5-anti mouse CD45单抗3 μl、Lin混合抗体2 μl、APC-anti mouse Sca-1单抗2 μl、PE-anti mouse c-kit单抗2 μl混匀,室温下避光20 min进行单抗标记，后加入1 ml溶血素避光8 min，再加PBS 2 ml以2000 r/min离心洗涤2次，随即上流式细胞仪检测KL、KSL细胞所占比例。

　　1.5 统计学处理 采用SPSS 11.5软件包进行统计分析,实验数据以±s表示，对数据进行方差分析和两两之间的q检验，P<0.05表示差异有显著性。

　　2 结果

　　2.1 动员前后WBC变化 见表1。A组用药前后WBC数量无明显变化;C组用药后每天的细胞数均比用药前和A组高(P<0.01)，用药过程中无明显变化;B组与D组用药后，随用药时间延长WBC数持续升高，第5天升幅最大，且在同时达高峰，高峰期B组与D组WBC明显高于A、C组和用药前(P<0.01)，但D组又明显高于B组(P<0.05);停药后第1天(d6)各实验组WBC数均明显下降。

　　表1 不同动员方案各时间点外周血WBC数(略)

　　与A组及d0比较：△△P<0.01;与C组比较：##P<0.01;与B组比较：*P<0. 05

　　2.2 动员前后KL细胞比例变化 见图1、图2。小鼠的HSPC免疫表型为Lin-c-kit+ (KL)[5-7]，A、C组小鼠用药后随用药时间延长KL细胞比例无明显变化;B、D组KL细胞比例随用药时间延长持续增高，D组用药后每天的比例均比B组高，第5天升幅最大，且均在第5天达高峰，高峰期B、D组细胞比例分别为(0.294±0.030)%和(0.433±0.071)%;高峰期B、D组与动员前及A、C组比较,KL细胞比例明显增高(P<0.01)，但D组又比B组高(P<0.05);C组与用药前及A组比较无显著性差异(P>0.01);停药后第1天各实验组KL细胞比例均明显下降。

　　图1 各组KL细胞流式结果图(略)

　　A.小鼠KL细胞流式同型对照图;B、C、D、E图分别为A、C、B、D组d5 KL细胞流式结果图

　　图2 各组用药前后KL细胞比例变化图(略)

　　与A、C组比较:##P<0.01;与B组比较：*P<0.05

　　2.3 动员前后KSL细胞比例变化 见图3、图4。小鼠的HSC免疫表型为Lin-c-kit+Sca-1+ (KSL)[5-7]，A、C组小鼠用药后随用药时间延长KSL细胞比例无明显变化;B、D组细胞比例持续增高，D组用药后每天的比例均比B组高，B组在第5天升幅最大，D组则在第4天升幅最大,但均在第5天达高峰，高峰期B、D组细胞比例分别为(0.138±0.027)‰和(0.191±0.083)‰;高峰期B、D组KSL细胞比例与动员前及A、C组比较，显著增高(P<0.01)，但D组又较B组高(P<0.05);C组用药后KSL细胞比例与用药前及对照组相比无显著性差异(P>0.05)，停药后第1天各实验组KSL细胞比例均明显下降。

　　图3 各组小鼠KSL细胞流式结果图(略)

　　A.小鼠lin-细胞群流式同型对照图,图门为圈定的lin-细胞群;B、C、D、E图分别为A、C、B、D组d5 Lin-流式结果图;F. A图lin-细胞群中c-kit+Sca-1+的同型对照图;G、H、I、J图分别为A、C、B、D组d5 c-kit+Sca-1+细胞群流式结果图

　　图4 各组小鼠用药前后KSL细胞比例变化图(略)

　　与A、C组比较:##P<0.01;与B组比较：*P<0.05

　　3 讨论

　　正常生理情况下，HSPC大多数定植于骨髓内，一小部分在外周血，这部分HSPC仍具有增殖分化的能力，可被应用于PBHSCT[8]。通常情况下,健康供者外周血中HSPC的数量很低，若要保证移植成功，需要进行动员使外周血的HSPC达到足够的数量。细胞因子rhG-CSF因具有较强的动员作用而被广泛应用于临床,效果显著。最近报道交感神经可以参与HSPC的动员，并且应用肾上腺素后可使小鼠外周血WBC数增高，骨髓KSL细胞比例升高。那么rhG-CSF联合肾上腺素动员小鼠就有可能升高外周血HSPC的数量，为验证此推测，我们设计了本实验，发现研究结果与推测相符。

　　在我们的研究中,小鼠被注射肾上腺素后,外周血WBC数较对照组和用药前明显升高,但KL、KSL细胞比例与对照组比较变化不大，原因可能是肾上腺素使小血管收缩，血流加速，仅能使附于边缘池血管壁的粒细胞脱落进入循环池，而骨髓(贮存池)中的成熟粒细胞与HSPC很少进入外周血[9]，这与文献单用交感神经递质无法动员HSPC的结果一致[2]。rhG-CSF动员小鼠后外周血WBC数及KL、KSL细胞比例变化趋势与以往文献基本相同，每天持续增高，在第5天增幅最大，且同时达高峰期，停药24 h后明显下降[10]。rhG-CSF与肾上腺素联合注射小鼠后，增高趋势与单用rhG-CSF基本相同，外周血WBC数及KL、KSL细胞比例每天持续增高，第5天达高峰，但是三者数值每天均比单用rhG-CSF高，这可能由以下两方面机制独立或联合引起：一方面，可能是rhG-CSF与肾上腺素协同使骨髓微环境内HSPC增殖并增加其迁移能力，间接抑制成骨细胞功能,下调骨髓微环境CXCL12 mRNA与黏附分子CXCL12水平的表达，从而使更多的HSPC摆脱骨髓微环境的束缚，定向迁移至骨髓血窦,最终移行穿越血管基底膜与内皮细胞层而进入外周血[4，8，11];另一方面，肾上腺素增加血流速度，收缩血管，使附着于血管壁的细胞进入血液循环，从而改变机体血细胞的分布，使骨髓内HSPC更多地进入外周血[9]。因此, rhG-CSF与肾上腺素联用能协同地动员HSPC,也验证了交感神经系统参与刺激因子动员HSPC的假说，但是肾上腺素参与动员的机制、最佳用药剂量、时间关系及副作用等问题仍需进一步研究，这些问题的解决，有可能为改进HSPC动员方案提供新的思路。

　　【参考文献】

　　[1] Bellucci R, De Propris MS, Buccisano F, et al. Modulation of VLA-4 and L-selectin expression on normal CD34+ cells during mobilization with G-CSF [J]. Bone Marrow Transplant, 1999, 23(1): 1-8.

　　[2] Katayama Y, Battista M, Kao WM,et al. Signals from the sympathetic nervous system regulate hematopoietic stem cell egress from bone marrow [J]. Cell, 2006, 124(2): 407-421.

　　[3] Takeda S, Elefteriou F, Levasseur R,et al. Leptin regulates bone formation via the sympathetic nervous system [J]. Cell, 2002, 111(3): 305-317.

　　[4] Spiegel A, Shivtiel S, Kalinkovich A,et al . Catecholaminergic neurotransmitters regulate migration and repopulation of immature human CD34+ cells through Wnt signaling [J]. Nat Immunol, 2007, 8(10): 1123-1131.

　　[5] Xing Z, Ryan MA, Daria D, et al. Increased hematopoietic stem cell mobilization in aged mice [J]. Blood,2006, 108(7): 2190-2197.

　　[6] Okada S, Nakauchi H, Nagayoshi K, et al. In vivo and in vitro stem cell function of c-kit- and Sca-1-positive murine hematopoietic cells [J]. Blood, 1992, 80(12): 3044-3050.

　　[7] Pelus LM, Fukuda S. Peripheral blood stem cell mobilization: the CXCR2 ligand GRObeta rapidly mobilizes hematopoietic stem cells with enhanced engraftment properties [J]. Exp Hematol， 2006，34(8):1010-1020.

　　[8] Papayannopoulou T, Scadden DT.Stem-cell ecology and stem cells in motion [J]. Blood, 2008, 111(8): 3923-3930.

　　[9] 朱大年, 吴博威, 樊小力, 等. 生理学[M]. 7版. 北京: 人民卫生出版社, 2008: 56.

　　[10] 高立艳, 徐开林, 潘秀英. rhG - CSF和rhGM - CSF动员小鼠外周血干细胞效果的比较研究[J]. 徐州医学院学报, 2007, 27(10): 635-639.

　　[11] Semerad CL, Christopher MJ, Liu F, et al. G-CSF potently inhibits osteoblast activity and CXCL12 mRNA expression in the bone marrow [J]. Blood, 2005, 106(9): 3020-3027.