重组腺相关病毒介导的人凝血因子IX基因在人/鼠结肠癌上皮细胞中的表达

　　作者：马泳泳，陈方平，杜建伟，陈焱，彭建强，吴小兵，解勤之 作者单位：1.温州医学院第一附属医院 血液内科，浙江 温州 325000

　　【摘要】 目的:探讨重组腺相关病毒/人凝血因子IX 基因(rAAV-2/hFIX)在人/鼠结肠癌上皮细胞(SW480/C26细胞株)中的表达。方法:重组腺相关病毒/绿色荧光蛋白(rAAV-2/GFP)感染SW480/C26细胞，在荧光显微镜下观察GFP的表达，计算转染率。rAAV-2/hFIX感染SW480/C26细胞，检测hFIX基因、FIXAg量及hFIX活性的表达。结果:SW480细胞株/C26细胞株GFP48hr阳性率分别为(57.0±8.5)%和(48.0±5.7)%;转导组14 d和21 d均可见外源hFIX的cDNA片断。SW480细胞转导了rAAV-2/hFIX后在第2天和第21天ELISA法测hFIX抗原量分别为(98.0±4.3)和(30.9±6.5)ng·106cell-1·24h-1。未转导组为(2.7±0.1)ng·106cell-1·24h-1。C26细胞转导了rAAV-2/hFIX后在第2天测hFIX抗原量为(78±5.12)ng·106cell-1·24h-1。未转导组为(2.9±0.1)ng·106cell-1·24h-1。hFIX活性与hFIX抗原浓度明显相关。较对照组亦显著增高。结论:rAAV-2/GFP能有效地转导SW480/C26细胞。rAAV-2/hFIX能有效地转导SW480/C26细胞并表达具有凝血活性的功能蛋白hFIX。

　　【关键词】 血友病B; 基因治疗法; 重组腺相关病毒; 人凝血因子IX基因; 结肠上皮细胞

　　Expression of recombinant adeno-associated virus/human coagulant factor IX gene in human/rat colon carcinoma cells MA Yong-yong*, CHEN Fang-ping, DU Jian-wei, CHEN Yan, PENG Jian-qiang, WU Xiao-bin, XIE Qin-zhi. *Department of Hematology,the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical College, Wenzhou, 325000

　　Abstract: Objective: To study the expression of recombinant adeno-associated virus/human coagulant factor. Methods: rAAV-2/GFP was transferred to human/rat gut epithelial cells, the expression of GFP was detect and the transduction efficiency was measured.rAAV-2/hFIX was transducted to human/rat gut epithelial cells. The expressions of hFIX were studied in the parameters of DNA, protein and biological activity. Results: (57.0±8.5)% SW480 cells expressed the GFP gene on the 2nd day. (48.0±5.7)% C26 cells expressed the GFP gene on the 2nd day.The hFIX cDNA expressions were found in DNA extracted from both the SW480 and C26 cells after transduction. Elevated level of hFIX antigen and biological activities were detected and persisted for 21 days with(98.0±4.3)ng·106cell-1·24h-1 and(78.0±5.1)ng·106cell-1·24h-1 of the C26 cells while the negative control was(2.9±0.1)ng·106cell-1·24h-1.The expression of hFIX antigen was in accordance with coagulant activity. Both the SW480 and C26 cells after transduction showed remarkable higher coagulant activities than that of the negative control. Conclusion:The results indicate that the SW480/C26 cells after transduction are capable of producing hFIX with an elevated level of hFIX antigen and biological activity. rAAV-2/GFP can effectively transducte to the SW480 and C26 cells.

　　Key words: rosiglitazoneon; endothelial progenitor cells; hydrogen dioxide; oxidative stress

　　血友病B是一种凝血因子IX(hFIX)基因缺陷引起的单基因出血性疾病。已证实有许多细胞能分泌具有生物学活性的hFIX，血友病B已成为基因治疗的首选疾病。基因治疗的关键在于载体和靶细胞。重组腺相关病毒(rAAV)是理想的基因治疗载体。靶细胞的选择对hFIX 的表达极其重要，它关系到给药方式。目前多选择成纤维母细胞、肝细胞或肌细胞为靶细胞，以肌注或门静脉或肝动脉穿刺的方式，但此两种方式均为有创性，分泌量较低，给药同时须大量输注凝血因子，花费大，病人依从性差。如果以消化道上皮细胞作为FIX的靶细胞，则可实现无创。结合人凝血因子IX rAAV-2载体与结肠上皮细胞两者的优势，我们设计以结肠上皮细胞为靶细胞，观察rAAV-2/hFIX在结肠上皮细胞的转导和表达水平。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 试剂：DMEM培养液、PBS (购自湘雅医院中心实验室)，胎牛血清(Gibco)，0.25% trypsin(Gibco)。凝血因子IX含量测定(ELISA)试剂盒为上海太阳生物技术公司产品;乏IX血浆、正常标准血浆、APTT促凝剂(高岭土)为美国Pacific Hemastasis产品。10 mmol/L dNTP、DNA分子量标准均购自晶美生物公司;根据PCR引物设计原则，参照文[1]献设计hFIX引物，由北京鼎国公司合成。G3PDH引物系人鼠通用引物，由长沙科泰公司合成。

　　1.1.2 仪器:超净工作台为苏净集团安泰公司产品;LD4-2型低速离心机为北京医用离心厂产品;Zeiss倒置荧光显微镜为上海蔡司光学仪器国际贸易有限公司产品;倒置光学显微镜为日本Olympus公司产品;CO2细胞培养箱为美国Forma Scientific公司产品;DNA真空干燥仪为美国Savant公司产品;DU640型紫外分光核酸蛋白分析仪为美国BECKMAN公司产品;DYY-6B型稳压稳流电泳仪为北京六一仪器厂产品;紫外透射仪、天能GIS凝胶图像处理系统GIS 3.03为上海天能科技有限公司产品;TGL-16G型台式离心机为上海医用分析仪器厂产品;DYADTM DNA Engine PCR仪为美国M J Research公司产品;ELISA仪为ELx800 BIO-TEK Instruments.Inc产品。

　　1.2 病毒和细胞株 病毒rAAV-2/GFP和rAAV-2/hF IX由病毒基因工程国家重点实验室吴小兵教授惠赠。rAAV-2/GFP，滴度为5×1011 v.g/ml,纯度大于98%。rAAV-2/hF IX，滴度为1×1012 v.g/ml，纯度大于98%。pSNAV1GFP/FIX载体质粒由GFP/FIXcDNA正向插入通用型AAV载体质粒pSNAV1的克隆位点构建而成， rAAV-2/GFP病毒的包装、纯化、滴度及纯度的测定按文献[2-4]方法进行。人结肠癌细胞株SW480、大鼠结肠癌细胞株C26购自湘雅医学院肿瘤研究所。

　　1.3 细胞培养 将SW480/C26细胞培养于含10% PBS的DMEM培养液、37 ℃ 5% CO2饱和湿度的培养箱中常规传代培养。

　　1.4 rAAV-2/GFP体外转导SW480/C26细胞 将SW480/C26细胞以2×105 cell/孔的密度接种于24孔细胞培养板，6个复孔，DMEM培养基(含10% PBS)，37 ℃ 5% CO2饱和湿度培养约12 h。待SW480/C26细胞80%铺满后，弃去上清液，用不含PBS的DMEM培养基洗涤3次。计数细胞，用rAAV-2/GFP感染24孔板中生长的SW480/C26细胞，MOI 1×105 v.g/cell，在不含PBS的DMEM培养基200μl内培养，37 ℃ 5% CO2饱和湿度培养约2 h。弃去上清液，DMEM培养基洗涤3次。加入DMEM培养基(含10% PBS)1 ml，37 ℃ 5% CO2培养。14～48 h后，在倒置荧光显微镜下观察GFP在细胞中的表达，发出绿色荧光的即为GFP阳性细胞。2～3 d传代一次，弃去培养液，PBS液洗涤3次，加入0.25%胰蛋白酶150μl/孔，37 ℃作用5 min左右，倒置显微镜下观察到细胞间隙增大即中止消化，以1:3比例传代。分别于转导后2 d、7 d计数200个细胞在荧光显微镜下绿色荧光的百分率，即转染率。

　　1.5 rAAV-2/hFIX体外转导SW480/C26细胞 SW480/C26细胞以3×105/ml的密度种植于12孔培养板，在含10% PBS的DMEM培养基中培养，24 h后，用不含血清的DMEM培养液洗涤3次，细胞计数，加入rAAV-2/hFIX，MOI 1×105 v.g/cell，设3个复孔。同时设阴性对照。培养约2 h后洗涤2次，换成含10% PBS DMEM培养液，分别在2 d、7 d、14 d和21 d取5×105细胞，洗涤2次后重悬于无血清培养基中，种植于24孔板，1 ml/孔，加入维生素K1 4μg/ml，24 h后收集上清液，同上做各项检测。

　　1.6 细胞总DNA的提取 按常规方法提取DNA后鉴定DNA的质量，测定DNA的浓度和纯度。

　　1.7 PCR法检测rAAV-2/hFIX转导的细胞中hFIX基因的表达 hFIX上游引物:5′-CTTGATCATGAAAACGCCAA-3′，下游引物：5′-AACATACTGCTTCCA AAATT-3′，产物长度183 bp或371 bp;G3PDH上游引物:5'-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3'，下游引物：5'-TCCACCACC CTGTTGCTGTA-3'，产物长度439 bp。反应总体积为25μl体系：DNA模板2μg，10×Buffer2.5μl，10 mmol/L dNTPs 0.5μl，Taq DNA聚合酶(2 u/μl)0.5μl，hFIX上游引物和下游引物(10 pmol/μl)各1.5μl，灭菌去离子水加至25μl。反应条件：95 ℃ 预变性8 min，90 ℃变性30 s，52 ℃退火30 s，65 ℃延伸2 min，重复30个循环后65 ℃延伸10 min。PCR产物4 ℃保存。扩增内参基因时，用G3PDH引物替代hFIX引物，其余条件一致。

　　1.8 酶联免疫吸附法(ELISA)检测培养细胞上清液中hFIX抗原的含量 按试剂盒提供的方法进行。在波长492 nm处测定各孔OD(optical density，光密度)值。以OD值对hFIX 标准血浆含量%作半对数标准曲线，求出回归方程，以正常人标准血浆IX因子蛋白浓度为5 000 ng·ml-1，计算各测定样本hFIX蛋白浓度。

　　1.9 一期法检测培养细胞上清液中hFIX的活性 APTT时间参照王振义等[5]报告的方法测定。以标准血浆稀释度为横坐标，凝固时间为纵坐标作双对数标准曲线，并计算回归方程，得出待测样本的hFIX活性。

　　1.10 统计学处理方法 两组比较采用t检验;hFIX活性与hFIX抗原浓度之间采用直线相关分析。

　　2 结果

　　2.1 rAAV-2/GFP对SW480/C26的体外转导 2 d可见大部分细胞发出明亮的绿色荧光，小部分细胞未见荧光，7 d后可见发出绿色荧光的细胞较2 d时减少，且荧光亮度明显减弱，阴性对照组无荧光。计数200个细胞在荧光显微镜下绿色荧光的百分率，2 d、7 d荧光显微镜下所见如图(图1)。

　　2.2 SW480/C26细胞hFIX基因的表达 PCR方法检测了SW480/C26细胞DNA的hFIX基因的表达，SW480未转导组的14 d、21 d DNA仅扩增出一条阳性条带，大小为371 bp，而转导组的14 d和21 d的DNA扩增后均可见到两条阳性条带，大小为371 bp和183 bp，分别为内源的hFIX基因片断和外源hFIX的插入片断(图2);C26细胞未转导组DNA未见到阳性条带，而转导组14 d、21 d的DNA均可扩增出一条清晰的阳性条带，大小为183 bp(图3)。SW480/C26细胞扩增了内参，扩增片断大小为439 bp。

　　2.3 SW480/C26细胞在不同培养时段FIX的抗原量的表达 在492 nm波长处测吸光度(OD)值，以OD值对正常标准血浆含量绘出标准曲线(图4)，拟合曲线方程为：lgY=Y0+aX+bX2+cX3(其中Y0=-1.923 4，a=4.425 1，b=-1.909 24，c=0.305 3)。以混合正常人血浆FIX蛋白浓度为5 000 ng/ml，求出各样本的hFIX浓度。5例正常人的hFIX浓度为(4 792.2±421.3)ng/ml。转染后的SW480细胞/C26细胞hFIX抗原量见表1，与未转导组相比较，SW480细胞hFIX抗原的分泌量在第2天、第7天、第14天、第21天成组t检验，P<0.01，差异有显著性。C26细胞hFIX抗原的分泌量与未转导组相比较，第2天、第7天、第14天、第21天成组t检验，P<0.01，差异有显著性。

　　2.4 SW480/C26细胞在不同时段分泌的hFIX的活性 以正常标准血浆的稀释度(%)和凝固时间(S)做双对数曲线，两者之间呈正比，绘出标准曲线(图5)，lgY=a+blgX(其中a=2.1971，b=-0.2928)。转染后的SW480细胞/C26细胞hFIX活性见表2，与未转导组相比较，SW480细胞hFIX活性第2天、第7天、第14天、第21天成组t检验，P<0.01，转导组与未转导组差异有显著性。C26细胞与未转导组相比较，第2天、第7天、第14天、第21天成组t检验，P<0.01，转导组与未转导组差异有显著性。

　　2.5 hFIX活性与hFIX抗原浓度的相关性分析 培养细胞上清液中hFIX抗原浓度与hFIX活性之间呈显著正相关。SW480细胞(r=0.9，P<0.01);C26细胞(r=0.9，P<0.01)。

　　3 讨论

　　目前临床治疗血友病B主要方法为输血、补充凝血酶原复合物或补充hFIX浓缩制剂。给药途径为肌注或静脉注射，但此两种方式均为有创性，给药同时亦有肌肉出血及局部血肿形成的风险。如果以消化道上皮细胞作为FIX的靶细胞，则可实现无创。口服途径的hFIX可能会被胃液降解，而肠上皮细胞介导hFIX的表达则具有特定的优势：①可以避免介入性方式造成的损伤，如肌肉注射、门静脉注射、骨髓输注或血管内输注。②由于肠上皮细胞的新陈代谢快，大量快速分化的细胞可作为基因转移的靶细胞，易于被转染，单从细胞数量上，小肠就是一种极具吸引力的靶组织。③肠上皮细胞下几微米处即有丰富的毛细血管网，这对血友病B这种血浆蛋白缺陷性疾病的基因治疗亦有很大优势。另外，肠上皮细胞还有不受消化酶影响、小儿依从性好、由门静脉直接吸收入肝而达到有效的肝脏途径结果等优势。我们设计以结肠上皮细胞为靶细胞，观察rAAV-2/hF IX在结肠上皮细胞的导入和表达水平。实验所用的SW480细胞是良好的口服吸收的体外筛选模型。SW480细胞来源于人体结肠腺癌细胞，能在培养过程中进行肠细胞分化，其单细胞层可作为研究小肠表皮细胞转运和代谢的体外模型，具有生长快、代谢周期短的优点。SW480细胞在体外所得结果与人体口服吸收程度相关性良好。C26细胞则为进一步的动物试验打下基础。目前关于结肠癌上皮细胞及结肠上皮细胞病毒转导效率的研究尚未见报道。Lozier JN等[6]将含hFIX的逆转录病毒载体(AVI.LacZ 4)转导入IEC6，IEC18(rat small intestinal epithelial cell lines)，IPEC-1在不同的MOI下转染效率是不同的，在MOI为10：1时，三种原代细胞上皮的转染效率分别是23%、47%、85%。本实验的MOI 1×105 v.g/cell时，SW480细胞株2 d、7 d阳性率分别为(57.7±8.5)%、(39.0±5.7)%;C26细胞株2 d、7 d阳性率分别为(48.8±5.7)%、(35.2±4.6)%。结果与Lozier JN等[6]原代结肠上皮细胞病毒转导中位转导效率相近。

　　腺相关病毒(AAV)是一种单链的微小DNA病毒，具有与人类疾病无相关性、免疫原性弱、宿主范围广及能长期表达外源基因的特点,并能感染非分裂期的细胞[7，8]，是较理想的基因治疗载体。现在多认为AAV载体进入宿主体内后可能既有随机整合，也有附加体的形式。AAV-2的转导效率主要与靶细胞种属、表面病毒受体的表达、感染复数和细胞周期有关。AAV-2分子病毒学的研究显示，AAV-2对细胞的进入是受体介导的,硫酸乙酰肝素蛋白多糖(HSPG)是AAV-2的主要受体，I型成纤维细胞生长因子受体(FGFR1)和αVβ5整合素是AAV-2的辅助受体[9]。还有学者报道c-met可能也是AAV-2的一种辅助受体。有研究证实，如果细胞表面仅表达主要受体，而无辅助受体表达，则不能导致AAV-2的有效感染[10]。本实验SW480/C26细胞株转导后14 h细胞内即有GFP表达，48 h达高峰，7 d时仍维持较高GFP阳性率，表明rAAV可有效地转导SW480/C26细胞， SW480/C26细胞表面均具有上述两类受体，可介导rAAV-2进入靶细胞体内表达外源基因。本实验还比较了7 d和2 d GFP表达率的高低，发现SW480/C26细胞系在7 d GFP表达率均低于2 d的GFP表达率，具统计学意义，但外源基因能否长期稳定表达，还需进一步实验验证。

　　体外FIX表达已经在几种细胞系及原始细胞中获得成功,如成纤维细胞、肌细胞、肝细胞、内皮细胞、角质细胞、造血干细胞等[11-17]。其中主要是成纤维细胞、肝细胞及肌细胞。rAAV/hFIX对肠上皮转导具有不确定性，人们对肠上皮是否有谷氨酸羧化酶，能否分泌具有生物活性的hFIX还存在疑虑。目前关于hFIX 在肠上皮中的表达的研究，载体限于逆转录病毒、腺病毒、脂质体[5]，而rAAV/hFIX 在人/鼠肠上皮细胞中的表达尚未见报道。Lozier JN等[6]将含hFIX的逆转录病毒载体转导入IEC6，IEC18(rat small intestinal epithelial cell lines)，IPEC-1，T84(human colon cell lines)，结果示抗原分泌量与凝血活性的上升有相关性,提示IEC6、IEC18、IPEC-1、T84均可以有效地修饰hFIX，并分泌至上清液中。hFIX内含子1可提高hFIX的转录和mRNA的稳定性，促进hFIX的表达，已在多种细胞(HEL、CHO、HepG2、肌肉细胞等)中得到证实[16]。本实验选用含有hFIX内含子1的rAAV-2/hFIX，转导SW480/C26细胞获得了hFIX的表达，SW480/C26细胞转导了rAAV-2/hFIX后分别在第2天、第7天、第14天和第21天ELISA法测hFIX抗原量较未转导组均有增高。以第2天为最高，与GFP阳性率相一致，其后hFIX抗原量渐减，第14天抗原量与第21天比较差异无显著性。同时一期法测hFIX的活性，SW480/C26细胞较未转导组第2、7、14、21天均有增高。以第2天为最高，与GFP阳性率和hFIX抗原量相一致，其后hFIX抗原量渐减，第14天抗原量与第21天比较差异无显著性。hFIX活性与hFIX抗原浓度明显相关。从而证明该载体可有效地介导hFIX的表达。但外源基因能否长期稳定表达，还需进一步实验验证。

　　综上所述，本实验显示rAAV 可以介导hFIX有效地转导人/鼠肠癌上皮细胞(SW480/C26细胞)并表达具有凝血活性的功能蛋白hFIX，为rAAV-2介导的以肠上皮为靶细胞的血友病B的基因治疗奠定了基础。

　　【参考文献】

　　[1] 周洁民, 戴一凡, 邱信芳, 等. 用多聚酶链式反应快速检测转化细胞中外源人凝血因子IX cDNA[J]. 科学通报, 1990,35(8): 625-628.

　　[2] 张之南,杨天楹,郝玉书.血液病学 [M].北京:人民卫生出版社, 2003:1708-1719.

　　[3] Choo KH, Gould KG, Rees DJ, et al. Molecular cloning of the gene for human anti-haemophilic factor IX[J]. Nature,1982,299(5879):178-180.

　　[4] Kurachi K, Davie EW. Isolation and characterization of a cDNA coding for human factor IX[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1982,79(21): 6461-6464.

　　[5] 王振义.血栓与止血//基础理论与临床[M].上海:科学技术出版社,1996:121-125.

　　[6] Lozier JN, Yankaskas JR,Ramsey WJ.Gut epthilial cells as targets for gene therapy of hemophilia[J].Human Gene Ther,1997,8(12):1481-1490.

　　[7] Podsakoff G, Wong KK, Chatterjee S. Efficient gene trans-fer into nondividing cells by adeno-associated virus-based vectors[J]. J Virol,1994, 68(9): 5656-5666.

　　[8] 何睿，韩忠朝. 基因治疗血友病B 的研究进展[J].中华血液学杂志，2003,24 (3): 761-762.

　　[9] Negishi A,Chen JH,McCarty DM,et al. Analysis of the inter-action between adeno-associated virus and heparan sulfate using atomic force microscopy[J]. Glycobiology, 2004,14(11):969-977.

　　[10]Cao B, Pruchnic R, Ikezawa M. The role of receptors in the maturation-dependent adenoviral transduction of myofibers [J].Gene Ther,2001,8(8):627-37.

　　[11]Axelrod JH, Read MS, Brinkhous KM, et al. Phenotypic correction of factor IX deficiency in skin fibroblasts of hemophilic dogs[J]. Proc Natl Acad Sci USA,1990,87(13): 5173-5177.

　　[12]陈晓光, 朱焕章, 李峰, 等. 重组慢病毒介导的人凝血因子IX cDNA在培养细胞和血友病B小鼠中的表达[J]. 科学通报, 48(18): 1949-1953,2003.

　　[13]St Louis D, Verma IM. An alternative approach to somatic cell gene therapy[J]. Proc Natl Acad Sci USA,1988,85(9): 3150-3154.

　　[14]Palmer TD, Hock RA, Osborne WR, et al. Efficient retrovirus-mediated transfer and expression of a human adenosine deaminase gene in diploid skin fibroblasts from an adenosine deaminase-deficient human[J]. Proc Natl Acad Sci USA,1987,84(4): 1055-1059.

　　[15]薛京伦, 卢大儒, 周洁民, 等.成纤维细胞基因治疗血友病B的临床I期试验[J]. 中国科学,1993,23(1):53-60.

　　[16]Cherington V, Chiang GG, McGrath CA, et al. Retroviral vector-modified bone marrow stromal cells secrete biologi- cally active factor IX in vitro and transiently deliver thera-peutic levels of human factor IX to the plasma of dogs after reinfusion[J]. Hum Gene Ther,1998,9(10): 1397-1407.

　　[17]Rodriguez MH, Enjolras N, Plantier JL, et al. Expression of coagulation factor IX in a haematopoietic cell line[J]. Thromb Haemost,2002,87(3): 366-373.