PUVA诱导K562细胞凋亡时对Fas表达的影响

　　作者：张励，陈楠楠，刘小宇，王伟，黄世林 作者单位：解放军第210医院 中医血液科，辽宁 大连 116021

　　【摘要】目的 探讨补骨脂素(PSO)加长波紫外线(UVA)光化学疗法(PUVA)诱导人白血病细胞K562凋亡时对Fas表达的影响。方法 以K562细胞为研究对象，以细胞凋亡率、电镜下细胞超微结构改变以及细胞Fas基因表达水平、蛋白表达水平为检测指标，观察中药补骨脂中提取的PSO加波长为360 nm 的UVA 对人白血病细胞诱导凋亡的作用以及部分作用途径，并采用多因素方差分析法进行统计学处理。结果 (1)单纯PSO、单纯UVA照射及PUVA均可诱导K562细胞发生凋亡，PUVA的作用显著强于前两者。 (2)电镜下观察经PUVA处理后的K562细胞超微结构，可见明显的凋亡形态学改变。(3)单纯PSO、单纯UVA照射及PUVA均可上调K562细胞Fas基因表达水平， PUVA的作用显著强于前两者。(4)单纯PSO、单纯UVA照射及PUVA均可上调K562细胞Fas蛋白表达水平， PUVA的作用显著强于前两者。结论 (1)PUVA可诱导白血病细胞K562发生凋亡，作用强于单纯PSO及单纯UVA照射。(2)PUVA诱导K562凋亡的途径之一为上调K562细胞Fas基因表达水平。

　　【关键词】 补骨脂素 长波紫外线 白血病 K562细胞 凋亡 Fas

　　Effect of PUVA on Apoptosis and Expression of Fas in K562 Leukemia Cells

　　Zhang Li, Chen Nannan, Liu Xiaoyu, Wang Wei, Huang Shilin

　　(Department of Traditional Chinese Medicine and Hematology, PLA No.210 Hospital, Dalian 116021, China)

　　Abstract： Objective To explore the effect of psoralen (PSO) and longwave ultraviolet A (UVA) on apoptosis and expression of Fas in K562 leukemia cells.Methods K562 cells were taken as the study objects and their apoptosis ratios, ultrastructure changes and expression of Fas were detected in order that the effect of PSO extracted from Chinese herbal medicine and UVA (360 nm) on human leukemia cells could be observed. The factorial design and analysis of variance were used to analyze the interaction among the factors. Results (1) PSO, UVA and PSO+UVA (PUVA) all induced the apoptosis of K562 cells, but the effect of PUVA was stronger than that of the other two. (2) After having been treated with PUVA, all the K562 cells showed obvious changes in ultrastructure related to apoptosis under electron microscope. (3) Although PSO, UVA and PUVA all increased the expression of Fas gene, the effect of PUVA was stronger than that of the other two. (4) PSO, UVA and PUVA all increased the expression of Fas protein, and the effect of PUVA was stronger than that of the other two. Conclusion PUVA can induce the apoptosis of K562 cells and its effect is the strongest. One of the pathways to induce apoptosis is to upregulate the expression of Fas gene.

　　Key words： PSO;PUVA; leukemia; K562 cell; apoptosis; Fas

　　补骨脂素(psoralen，PSO)具有抗肿瘤、抗白血病的作用，同时又具有光敏活性[1～5]，波长范围在320～360 nm 之间的紫外光照射，可激发补骨脂素的动力效应，从而增强其抗肿瘤及抗白血病的作用。本实验由纯中药补骨脂中提取出PSO，以不同浓度加波长为360 nm、不同照射时间的长波紫外线(ultraviolet A，UVA)光照作用于K562细胞，通过流式细胞仪检测K562细胞株在补骨脂素加长波紫外线的光化学疗法(PUVA)后的凋亡情况;电镜下观察细胞超微结构改变，荧光定量PCR及流式细胞技术检测Fas基因、蛋白水平的表达情况，以探讨PUVA诱导K562细胞株凋亡的作用及部分作用途径。

　　1 材料与方法

　　1.1 细胞株 人红白血病K562细胞由大连医科大学惠赠。

　　1.2 药品及主要试剂 PSO由大连理工大学及我院共同由纯中药补骨脂中提取和制备。二甲基亚砜(DMSO)购自北京化工厂。RPMI1640培养液为Gibco产品。小牛血清系杭州四季青生物材料工程公司产品。Trizol为美国invitrogen产品。鼠抗人Fas(CD95)单克隆抗体为美国CALTAG实验室产品;Fas基因表达试剂盒购自中山大学达安基因股份有限公司。

　　1.3 仪器和设备 流式细胞仪购自美国贝克曼库尔特公司，GLY10型光量子血液平衡治疗仪由徐州华卫医疗设备公司研制，荧光定量PCR仪DA7600型购自中山大学达安基因股份有限公司。

　　1.4 细胞培养 K562细胞常规培养于含10%小牛血清的RPMI1640培养基(含硫酸庆大霉素0.025 U/ml)中，于37 ℃、5%CO2饱和湿度培养箱中进行连续培养。

　　1.5 实验分组 依据紫外线照射时间将实验组分为下列两组：(1)长波紫外线照射0 min 组;(2)长波紫外线照射5 min 组。

　　1.6 流式细胞术测定PUVA24 h 后 K562细胞的凋亡情况 取浓度为4.0×105/ml，处于对数生长期的K562细胞株5 ml，分别加入补骨脂素0、5、10、20、40 μl，使其在反应体系中的终浓度分别为0、10、20、40、80 mg/L，放入石英比色皿中，在GLY10型光量子血液平衡治疗仪(λ=360 nm)上以1 J/m2辐射量边照射边震荡，照射时间分别为0、5 min。处理后各实验组细胞继续培养24 h 后，收集5.0×105细胞，用PBS洗两次，弃上清，加入100 μl 碘化丙啶(PI)染液，避光反应30 min，加入PBS 400 μl，上机检测，并用Multicycle软件分析得出相应的细胞凋亡百分率。

　　1.7 透射电镜下观察细胞超微结构特点 收集浓度为5.0×105/ml，经PUVA处理的K562细胞10 ml，用PBS清洗两次，转入2.0 ml 离心管，离心(2 000 r/min)3 min，弃上清，缓缓加入2.5%戊二醛2 ml，4 ℃ 冰箱静置2 h 以上。磷酸缓冲液冲洗，锇酸固定、水洗、脱水、浸透、包埋，制定超薄切片，透射电镜下观察。

　　1.8 定量PCR技术检测PUVA4 h 后K562细胞Fas基因表达情况 (1)总RNA提取，采用Trizol一步法(美国GIBCO BRL公司)提取mRNA，按照试剂盒说明书操作。(2)cDNA合成，反应体系包括：5×逆转录buffer 4 μl(含Mg2+=4 mmol)，逆转录酶(200 U/μl)1 μl，dNTPs(10 mmol)0.5 μl，上游引物0.4 μl，下游引物0.4 μl，DEPC水 9.7 μl，RNA模板4 μl，总体积20 μl;反应条件：37 ℃ 1 h，95 ℃ 3 min。(3)将cDNA进行PCR扩增，反应体系包括：5×定量PCR　buffer 10 μl(含Mg2+=2 mmol)，Taq酶(3 U/μl)1 μl，Fas或FasL上游引物1.0 μl，下游引物1.0 μl，各自的荧光探针1.0 μl(注：上、下游引物，探针的终浓度均为10 pmol/L)，dNTP1 μl，ddH2O30 μl，cDNA模板5 μl，总体积50 μl;同时将制备的定量模板按照2×108、2×107、2×106、2×105、2×104梯度稀释，加入不同反应管中，在DA7600型荧光PCR仪进行扩增;反应条件：93 ℃ 2 min，93 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，共40个循环。(4)反应结束后由计算机自动计算定量结果，再通过换算得出每微克总RNA中Fas的mRNA拷贝数。上、下游引物及探针序列如下，Sequence Name：HFAS，Forward Primer: 5’GGG CAT CTG GAC CCT CCT A3’;Reverse Primer: 5’GGC ATT AAC ACT TTT GGA CGA TAA3’;Probe: 5’FAMCTC TGG TTC TTA CGT CTG TTG CTA GTAMRA3’。

　　1.9 流式细胞术测定PUVA24 h 后 K562细胞Fas蛋白表达情况 收集K562细胞1×106个，PBS洗涤1次后弃上清液，加入FITCFas抗体10 μl，避光孵育20 min，加500 μl PBS上机检测Fas蛋白表达，以FITCIgG1做对照。

　　1.10 统计学方法 所有实验结果均来自至少3组平行或三次重复实验。各种计量资料以平均值±标准差(x±s)表示，采用多因素方差分析;所有统计计算均用SPSS11.5 统计软件进行，P<0.05认为差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 PUVA诱导K562细胞凋亡的作用 应用流式细胞仪检测PUVA后24 h K562细胞株凋亡率，见表1。

　　表1 PUVA 后24 h K562细胞株凋亡率(略)

　　与0 min 组 0mg/L 浓度比较，①P<0.01;与0 min 组同浓度比较,②P<0.01

　　2.2 透射电镜下观察PUVA后细胞超微结构的改变 K562细胞出现细胞体积缩小，胞浆浓缩，胞核体积减小，可裂解成一个或数个致密体，可见核小体碎裂，核染色质聚集或边集，部分染色质致密成斑块状或沿核膜收缩成新月体状，整个细胞可裂解成大小不一凋亡小体。

　　2.3 荧光定量PCR技术检测PUVA4 h 后 K562细胞Fas基因表达情况 见表2。

　　表2 PUVA后4 h K562细胞Fas mRNA的表达(略)

　　与0 min 组 0mg/L 浓度比较，①P<0.01;与0 min 组同浓度比较,②P<0.01

　　2.4 流式细胞术测定PUVA24 h 后K562细胞Fas蛋白表达情况 见表3。

　　表3 PUVA后24 h K562细胞Fas蛋白表达(略)

　　与0 min 组 0 mg/L 浓度比较，①P<0.01;与0 min 组同浓度比较,②P<0.01

　　3 讨论

　　PSO是中药补骨脂种子中的主要成分，研究表明其具有光敏性质与抗肿瘤活性。当被365 nm 波长激发后能与细胞内DNA双链形成交联并释放单态氧等活性物质，使其抗肿瘤活性得到显著增强。本实验采用紫外波长为360 nm 的GLY10型光量子血液平衡治疗仪和(或)纯中药补骨脂中提取的PSO对实验组进行处理，对细胞凋亡率、电镜下超微结构改变进行检测、分析，证实PUVA对人红白血病K562细胞株有明显的诱导凋亡的作用，可以说明诱导白血病细胞凋亡是PUVA杀伤人类白血病细胞的途径之一。多因素方差分析结果显示， PUVA可诱导K562白血病细胞株发生凋亡，与对照组(0 min 0 mg/L)相比，不同浓度的PSO与不同照射时间的UVA对K562白血病细胞株的凋亡率有明显差异， K562细胞的凋亡率随着PSO浓度的增加，UVA照射时间的延长而增加。

　　Fas/FasL系统在传递细胞凋亡信号中起着重要作用[6]。K562细胞Fas的表达下降，当Fas水平下调至低于Fas/FasL途径诱导凋亡的阈值时，凋亡受到抑制。荧光定量PCR技术检测结果显示，PSO、UVA、PUVA均可上调Fas基因的表达，且PUVA的作用要显著强于前两者，经PUVA作用后，Fas基因表达拷贝数量级由对照组的104上调至107。流式细胞仪检测结果在蛋白质水平上进一步证实上述结果。由此，我们认为，PUVA诱导K562细胞发生凋亡的作用途径之一是对Fas/FasL系统的调控，通过上调Fas基因而诱导细胞凋亡。

　　【参考文献】

　　[1] 陈楠楠，黄世林，张德杰，等.补骨脂素加长波紫外线对人白血病细胞株NB4、HL60、K562作用的研究[J].中国中医急症，2007，16(4)：444-446.

　　[2] 吴少华，张仲海，赵建斌.补骨脂素体内外抗癌活性的实验研究[J].中国中药杂志，1998，23(5)：303-305.

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　　[5] Effercth T, Fabry U, Osieka R, et al. Induction of apoptosis, depletion of glutathione, and DNA damage by extracorporeal photochemotherapy and psoralen with exposure to UV light in vitro[J]. Anticancer Res, 2001, 21(4A):2777-2783.

　　[6] Nagata S, Golstein P. The Fas death factor[J]. Science, 1995,267(5203):1449-1456.