ACD保养液中树突状细胞的变化

　　作者：姚仁南，陈复兴，李玺，王振德，刘军权，张赞，赵勤，孙飞 作者单位：南京军区医学科技创新重点课题(08Z009) 中国人民解放军第九七医院输血科，江苏 徐州 221004

　　【摘要】 目的 检测人树突状细胞(DC)在 ACD保养液中不同时间的增殖和吞噬能力，为减少非溶血性输血反应提供实验依据。方法 抽取8例健康自愿献血者外周静脉血200 ml，ACD-B抗凝，4℃保存，在第1、2、3、4天分别取血20 ml，分离单个核细胞(PBMC)，孵育2 h洗涤后，贴壁细胞加入细胞因子联合诱导培养DC。灭活的酵母菌与DC以100∶1比例加入后37℃孵育1 h，取细胞悬液涂片，瑞-姬染色。光镜下计数吞噬酵母菌的DC，计算出DC的吞噬率和吞噬指数。结果 正常人外周静脉血第1天培养诱导的DC增殖生长良好，第2天仅有少量DC生长，第3、4天则无DC生长。第1天培养诱导的DC对酵母菌的吞噬率为78%～85%，平均值 81%，吞噬指数为 254。结论 在ACD保养液中的健康人的DC仅在离体后1～2天内能诱导增殖，诱导增殖后的DC具有较强的吞噬功能。DC 活性可能与某些非溶血性输血反应有关。

　　【关键词】 树突状细胞;ACD保养液;吞噬功能

　　Study on the changes of the dendritic cells in ACD preservative solution

　　YAO Rennan, CHEN Fuxing, LI Xi, WANG Zhende, LIU Junquan, ZHANG Zan, ZHAO Qin, SUN Fei

　　(Department of Blood Transfusion, The 97th Hospital of PLA, Xuzhou, Jiangsu 221004, China)

　　Abstract：Objective To provide experimental basis for clinical reduction of non-hemolytic transfusion reactions by detections of the proliferation and the phagocytic capacity of human dendritic cells (DC) in ACD preservation solution at different time points. Methods 200ml of peripheral vein blood was respectively collected from 8 healthy voluntary donors and was stored at 4℃, with anticoagulant ACD solution added. On days 1, 2, 3 and 4, 20 ml blood was respectively allocated to isolate peripheral blood mononuclear cells (PBMC). Having been incubated for 2 hours and rinsed, the adherent cells were supplemented with cell factors to induce DC culture. Inactivated yeast and the harvested DCs at the ratio of 100∶1 were incubated for 1 hour at 37℃, and Wright-Giemsa staining of the cell suspension smear was performed. The number of DCs that phagocytosed yeast was counted under the light microscope and the phagocytic rate and phagocytic index of DCs were calculated. Results The peripheral venous blood of normal donors of Day 1 had good proliferation of DCs and the blood of Day 2 had only a little growth of DCs, while the blood of days 3 and 4 had no DC growth. The phagocytosis rate of DCs induced and cultured on Day 1 was 78% ～ 85%, at an average of 81%, and phagocytic index was 254. Conclusion The DCs of healthy humans can only be induced to proliferate within 1 or 2 days after blood collection and preservation in ACD solution, and the induced proliferation of DCs has strong phagocytosis. The DC activity may be related to certain non-hemolytic transfusion reaction.

　　Key words: dendritic cells; ACD solution; phagocytosis

　　树突状细胞(dendritic cell，DC)是近年来倍受人们关注的一类抗原递呈细胞(antigen presenta tion cella，APC)[1]，可把抗原特异性地提呈给淋巴细胞而产生抗原特异性细胞免疫反应。因其功能和作用独特，近年来倍受人们关注。在血液保养液中DC的生存和功能状况国内尚未见报道。为此，我们对8例正常健康献血者的血液在采集后保存的不同时间进行DC的培养增殖，以及对DC对灭活酵母菌的吞噬功能进行实验研究。现将资料报道如下。

　　1 材料和方法

　　1.1 仪器和试剂 rhIL-4(比活性13×109 U/g)、rhTNF-α(比活性36×109 U/g)、rhIL-2(比活性40×109 U/g)为Promega公司产品，rhGM-CSF由中国军事医学科学院提供，RPMI 1640、胎牛血清为Gibico公司产品;淋巴细胞分离液(Ficoll，1.077)由上海第二制药厂提供，PE结合的鼠抗人单抗CDla、CD80及同亚型对照抗体兔鼠IgG1К为Pharmingen公司产品，FITC结合的CD14、CD86、HLA-DR和同型对照抗体FITC-mIgG1、PE-mIgG2a为BD公司提供，流式细胞仪为美国BD公司的FACSCaliar，分析软件为ELITE。

　　1.2 酵母菌悬液的制备 取鲜酵母(安琪酵母)1 g，生理盐水配成10%酵母菌悬液，1000 r/min离心5 min，洗涤3次，取上层液10 ml，沸水浴中30 min，取出后3000 r/min离心5 min，去除上清液后用生理盐水恢复同体积，1000 r/min离心5 min，取上层液备用。

　　1.3 DC的体外培养 参考文献[2]方法。抽取外周静脉血200 ml贮存，在第1、2、3、4天各分离出血液20 ml(培养用)，3000 r/min离心30 min，吸出富含白细胞层液约5 ml,用淋巴细胞分离液分离收集单个核细胞(PBMC)，PBMC用无菌生理盐水离心洗涤3次，1500 r/min离心15 min，用RPMI 1640完全培养基(内含10%胎牛血清和5%AB血清)将细胞密度调至2×109/L，加入6孔细胞培养板中，每孔3 ml，置37℃、5%CO2培养箱中孵育2 h。再用预热的培养基轻洗培养板2次，洗去未黏附的细胞即获贴壁的PBMC，每孔加入完全培养基(含200 μg/L rhGM-CSF和50 μg/L rhIL-4)3 ml，每2天半量换培养基，观察DC的形态和增殖情况等。

　　1.4 观察项目 将贮存的外周静脉血于第1、2、3、4天分别进行培养后，进行如下观察。

　　1.4.1 PBMC培养前后的变化 用流式细胞仪分析 PBMC培养前和培养7天后CD1a、CD14。

　　1.4.2 细胞生长特点及形态变化 培养7天后在倒置显微镜下观察DC细胞生长情况。

　　1.4.3 吞噬试验 将培养7天的DC细胞配成1×109/L悬液与酵母菌悬液(1×1011/L)等量混合。37℃孵育1 h，取出涂片，干燥后行瑞-姬染色。观察DC吞噬酵母菌的吞噬率和吞噬指数。

　　2 结果

　　2.1 PBMC培养生长增殖情况 采血当天分离的PBMC培养生长增殖良好，第2天分离的PBMC培养7天时每孔只有少量细胞生长，第3、4天分离的PBMC培养7天时未见生长。采血当天分离的PBMC培养前和培养7天后CD1a、CD14流式细胞分析见图1。

　　图1 PBMC培养前后CD1a、CD14流式细胞分析图(略)

　　2.2 细胞生长状况及形态 新鲜分离(第1天)的PBMC在倒置显微镜下观察为分散分布，无聚集现象，个体形状为表面光滑的球状细胞。经2 h贴壁，去除悬浮的淋巴细胞，剩下贴壁细胞加入不同的细胞因子组合的培养基中诱导培养7天。用倒置显微镜观察，其细胞形态不规则，有明显的树突状突起，并有成簇的聚集现象。将培养后的细胞悬液吸取后涂片自然干燥，进行瑞-姬染色，在光镜下可见：细胞染成蓝色，胞体呈不规则形，胞质丰富，有明显的毛刺样突起，胞核形态不规则，大多偏于一侧，部分细胞可见双核(图2)。

　　图2 培养7天后的树突状细胞(瑞-姬染色，×2000)(略)

　　2.3 DC与酵母菌混合孵育后形态观察 DC与灭活酵母菌混合孵育1 h后经瑞-姬染色光镜下观察细胞形态，绝大多数DC胞质内吞噬有多个酵母菌，数量从几个到十几个不等，以吞噬1～5个酵母菌为主。其形态以一个DC为中心，多个酵母菌被DC吞噬或围绕其周围，形成一种“卫星”现象。DC被染成蓝色，形态不规则。在突起的胞质中吞噬有数量不等的酵母菌，有的则围绕于细胞周围，胞核大多偏于一侧，酵母菌被染成紫红色(图3)。

　　图3 培养7天后的DC吞噬酵母菌情况(瑞-姬染色，×1000)(略)

　　2.4 吞噬率和吞噬指数计算 DC吞噬率：将DC与酵母菌混合孵育后涂片染色，用光镜计数200个DC，计算出吞噬酵母菌的DC，换成百分率为DC吞噬率。吞噬指数：计算100个DC吞噬酵母菌的数量为DC吞噬指数。见表1。

　　表1 培养7天后DC的吞噬率和吞噬指数(略)

　　3 讨论

　　DC是机体免疫反应的始动者，通过分泌各种因子参与固有和适应性免疫应答[3]。有研究表明可以通过调节DC的功能，如选择性激活或抑制DC的功能来调节免疫应答，对肿瘤、移植排斥反应、自身免疫性疾病的治疗与预防具有重要意义[4-6]。本实验对不同保存期血液进行了DC诱导培养增殖及吞噬酵母菌功能的实验观察。实验结果表明，DC培养最好是在血液采集后当天进行，第2天仅能培养出少量DC，血液离体后3天不能培养出DC。不同保存期血液诱导DC增殖能力和吞噬功能的研究结果显示，随着血液保存时间延长，DC增殖能力迅速下降，这除了与DC在末梢血中半衰期较短有关外，还可能与血液保存期间由于保存液中的营养、氧及维持细胞活性的相关介质等的缺乏有关。此外，是否还与DC在离体后黏附在聚氯乙烯血袋上有关，有待进一步研究证实。结果还表明，培养增殖后的DC在体外有很强的吞噬功能。在本实验中，我们的结果是DC的平均吞噬率为81%，吞噬指数为254。

　　有研究认为患者接受(输注)含白细胞的同种血液可使受血者免疫功能降低，某些肿瘤患者手术后复发率增高和引起非溶血性输血反应、临床输血出现非溶血性输血反应均与供血者血液中的白细胞有密切关系[7];输去白细胞血液可以减少受血者的免疫功能降低、肿瘤术后复发率的增高和引起非溶血性输血反应已被很多学者所证实[ 8 ];结合本实验结果发现血液离体后在ACD保养液中4℃条件下保存3天DC即不能培养增殖;推测输新鲜血易引起临床输血反应可能与DC的存活有一定的关系。输注保存时间相对较长(1周后)的库存血是否能起到去白细胞的作用，有待临床进一步研究。

　　本研究结果提示：离体血液保存3天后DC细胞失去增殖活性，临床应根据这一特性合理使用新鲜血液和库存血液;临床应用自体分离培养增殖DC用于各种疾病治疗时，采血后要及时培养处理，才能获得满意的效果。

　　【参考文献】

　　[1] Osada T,Clay TM,Woo CY,et al.Dendritic cell-based immunotherapy [J]. Int Rev Immunol,2006,25(5-6):377-413.

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　　[5] Morelli AE, Thomson AW. Tolerogenic dendritic cells and the quest for transplant tolerance [J].Nat Rev Immunol,2007，7(8): 610-621.

　　[6] Schreiner B, Mitsdoerffer M, Kieseier BC, et al. Interferon-beta enhances monocyte and dendritic cell expression of B7-H1 (PD-L1), a strong inhibitor of autologous T-cell activation: relevance for the immune modulatory effect in multiple sclerosis [J].J Neuroimmunol,2004,155(1-2):172-182.

　　[7] 姚仁南，黄晓静，李玺. 去除白细胞输血的临床意义[J].吉林医学，2006，27(5)：493-494.

　　[8] 姚仁南，陈复兴，徐开林. 同种输血对细胞免疫的负向调节及其预防[J].国外医学·输血及血液学分册，1998，21(4)：238-240.