新疆维吾尔族食管癌患者血清蛋白指纹图谱诊断模型的建立
发表时间：2010-07-09 浏览次数：362次
作者：徐淑永， 张琼， 张朝霞， 伊力亚尔·夏合丁， 余捷凯， 卢晓梅， 温浩 作者单位：新疆医科大学第一附属医院医学研究中心， 检验科， 胸外科， 新疆乌鲁木齐830011;浙江大学肿瘤研究所， 浙江杭州310009
【摘要】目的：筛选并建立新疆维吾尔族食管癌血清蛋白指纹图谱诊断模型,为食管癌的诊断与临床筛查提供新的途径。方法：采用弱阳离子交换蛋白质芯片(CM10蛋白芯片)及表面增强激光解析离子化飞行时间质谱(SELDITOFMS)技术对23例新疆维吾尔族食管癌和33例新疆维吾尔族正常对照者血清指纹图谱进行检测，所得结果用ZUCI蛋白芯片数据分析系统(ZUCIProtein Chip Data Analyze System)软件包进行分析，通过支持向量机运算建立区分新疆维吾尔族食管癌蛋白指纹图谱诊断模型，并用留一法交叉验证作用评估模型，判别效果。结果：通过软件包运算，用2个质荷比峰(3 269.462 1、6 056.871 4 m/z)建立了新疆维吾尔族食管癌蛋白指纹图谱诊断模型，准确度为92.9%，灵敏度为91.3%，特异度为93.9%，阳性预测值为91.3%。结论：SELDITOFMS技术结合支持向量机建立新疆维吾尔族食管癌血清蛋白质指纹图谱模型为早期筛查及诊断新疆维吾尔族食管癌提供了一种特异性强、灵敏度高的新方法，值得进一步的研究和应用。
【关键词】 维吾尔族; 食管癌; 蛋白质指纹图谱
Establishment of diagnostic model of serum protein fingerfrint patterns of Uygur′s esophageal cancer in Xinjiang and its clinical value
XU Shuyong, ZHANG Qiong, ZHANG Zhaoxia, et al
(Medical Research Center, First Affiliated Hospital, Xinjiang Medical University,Urumqi 830011, China)
Abstract: Objective: To analyze the alteration of serum protein patterns of Uygur′s esophageal cancer patients in Xinjiang by surfaceenhanced laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry (SELDITOFMS), screen and build diagnostic model of Uygur′s esophageal cancer in Xinjiang and investigate its clinical valur. Methods: SELDITOFMS and CM10 protein chip were used to detect the serum protein patterns of 23 cases with esophageal cancer and 33 healthy controls. The data was analyzed and the diagnostic model was established by using ZUCIprotein chip data analyze system software package. The diagnostic model was evaluated and validated by leave one cross validation. Results: A diagnostic model consisting of two protein peaks (3 269.462 1, 6 056.871 4 m/z) could do the best in the diagnosis between esophageal cancer and controls. Its accuracy was 92.9%, sensitivity 91.3%, specificity 93.9%, positive value 91.3%. Conclusion: The combination of SELDI with bioinformatics tools is a novel, effective, and highly specific and sensitive method for detection and diagnotis of esophageal cancer in Xinjiang Uygur.
Key words: Uygur; esophageal cancer; protein fingerprint
我国处于食管癌相对高发地带，新疆又是食管癌的高发区，张月明 [1]报道新疆维吾尔族食管癌的死亡率为12.72/10万，占癌症死亡总数的21.90%，因此寻找维吾尔族食管癌诊断标志物，早期发现、早期诊断食管癌是目前尚待解决的问题。本研究应用表面增强激光解析离子化飞行时间质谱(SELDITOFMS)技术，检测食管癌患者及正常人血清中蛋白指纹图谱表达，对采集的数据采用ZUCI蛋白芯片数据分析系统(ZUCIProtein Chip Data Analyze System)软件包进行分析，通过支持向量机运算建立区分食管癌和正常对照的蛋白指纹图谱诊断模型，为新疆维吾尔族食管癌的诊断与临床筛查提供了新的途径。
1 材料与方法
1.1实验仪器与试剂Protein Chip Biology System(PBSⅡc)质谱仪、弱阳离子交换蛋白质芯片(CM10蛋白芯片，Ciphergen Biosystems公司，US)。尿素(Urea)、乙腈(CAN)、3[3(胆酰胺基丙酸)二甲氨基]丙磺酸盐(CHAPS)、50%乙腈和0.5%三氟乙酸饱和溶液(SPA)、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(TrisHcl)、二硫苏糖醇(DTT)等均购自美国Sigma公司。96孔细胞培养板购自美国BD公司。
1.2研究对象收集2005年1月～2006年9月我院经手术病理诊断确诊为食管鳞癌的23例维吾尔族患者作为食管癌组，其中男性13例，女性10例，年龄36～75岁，中位年龄51岁。选取年龄、性别相匹配的肝功能、肾功能均正常且排除急性感染、过敏、自身免疫性疾病的33例维吾尔族体检者作为正常对照组。
1.3方法
1.3.1血清样本的处理空腹采不抗凝静脉血3 ml至离心管中，室温下静置30 min，3 000 r/min 离心20 min，每管100 μl分装血清，冻存于-80℃冰箱备用。取血清样本冰上溶解30 min，4℃12 000 r/min离心10 min，除去血清中的不溶物。在96孔细胞培养板中依次加入10 μl U9缓冲液(9 mol/L Urea,2% CHAPS,50 mmol/L TrisHcl, pH 9.0,1% DTT)和5 μl血清样品，将样品混匀。稀释血清样品冰浴震荡30 min，每隔5 min用手指轻弹混匀1次，然后向15 μl稀释血清样品中加入185 μl醋酸钠缓冲液(50 mmol/L NaAc, pH 4.0)，震荡器上混匀。将CM10蛋白芯片安装于加样器内，向AH加样孔中加入200 μl醋酸钠缓冲液，4℃震荡5 min，弃去缓冲液，重复上述操作1次。向每个加样孔中加入100 μl稀释血清样品，4℃震荡孵育1 h,弃去未结合样品，每孔加入200 μl醋酸钠缓冲液，震荡5 min，弃去缓冲液后，重复上述操作1次。每孔加入200 μl超纯水，立刻弃去。卸下加样器，待芯片表面自然晾干后，每点各加饱和SPA(5 mg SPA加入75 μl乙腈，75 μl 1% TFA，充分震荡5 min以确保SPA充分溶解，10 000 r/min离心1 min)2次，每次0.5 μl，两次点样之间需待芯片表面风干后再次点样。芯片处理好后上SELDITOFMS蛋白芯片阅读仪检测。
1.3.2数据收集与处理采用PBSⅡc型蛋白芯片阅读仪读取芯片信息，蛋白芯片阅读仪参数设置如下：激光强度设定为180，检测灵敏度8，优化相对分子质量范围是2 000～20 000，每张芯片打176个点，收集其中的144个点。采用ZUCIProtein Chip Data Analyze System 软件包进行数据分析，采用支持向量机(SVM)方法建立蛋白指纹图谱诊断模型，留一法交叉验证作为评估模型判别效果的方法。支持向量机采用径向基核函数,Gamma值设为0.6，罚分函数(C)设为19。特征向量的选取采用统计过滤结合模型依赖性筛选的方法，建立判别模型。对每个质荷比峰做Wilconxon秩和检验，检验水准α=0.01。建立并输出判别模型，用留一法评估模型的预测效果，选出建立支持向量机模型预测的约登指数最高的组合作为最终的候选标志物，建立的模型和留一法交叉验证的结果作为最终的结果。
2结果
2.1新疆维吾尔族食管癌血清蛋白指纹图谱诊断模型的建立23例新疆维吾尔族食管癌患者和33例新疆维吾尔族正常对照血清标本，在相对分子量0～50 000范围内，共检测到392个蛋白质荷比峰，其中132个差异有统计学意义(P<0.01)。通过软件包运算，用其中2个差异显著的质荷比峰(3 269.462 1，6 056.871 4 m/z)建立了维吾尔族食管癌血清蛋白指纹图谱诊断模型(表1);质荷比为3 269.462 1、6 056.871 4的蛋白峰(箭头所示处)在食管癌组中均高表达，在正常对照组中均低表达(图1)。
表1新疆维吾尔族食管癌组与正常对照组2个质荷比峰比较(略)
2.2留一法交叉验证诊断模型判别效果该诊断模型对23例食管癌组中21例判定正确，2例误判;对正常对照组31例判断正确，2例误判，其准确度为92.9%，敏感度为91.3%，特异度为93.9%，阳性预测值为91.3%。
图1食管癌组和正常对照组血清蛋白质图谱比较(略)
3讨论
目前，诊断食管癌的方法主要的有X线钡餐、CT、胃镜、MRI、内镜超声(EUS)等检查，但存在不易发现浅表性小癌灶、检查成本高、有创及一定的假阴性等诸多缺点，因此，临床对一些肿瘤标志物(如CA199、CA242、CA125、CA153等)进行研究，但消化系统肿瘤缺乏特异性，没有一种标志物可特异地用于食管癌的诊断，限制了其在临床的应用;且食管癌的治疗结果因患者就诊的早晚相差非常悬殊，以手术治疗为例，早期食管癌患者5年生存率在90%以上，而中晚期患者5年生存率为20%～30%[2]。食管恶性肿瘤的发生、发展是一个多因素、多阶段、多基因参与的复杂过程，包含了多个基因突变的分子事件，如癌基因的活化[3]、抑癌基因的功能丧失[4]等。因此，用单一肿瘤标志物或数个肿瘤标志物的简单叠加检测进行食管癌的早期诊断必定不可避免地存在敏感度和特异度的矛盾，寻找理想的生物标记物，探索食管癌早期诊断的有效手段成为亟待解决的问题。近年来蛋白组学的飞速发展为寻找新的肿瘤标志物提供了新的技术平台，本研究中所应用的SELDITOFMS技术是当今最先进的蛋白组学技术之一[5]。国内外学者应用此项技术检测前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、直结肠癌及肝癌[6～11]等恶性肿瘤患者的血清标本，建立相应的肿瘤蛋白指纹图诊断模型，其敏感度和特异度均比以往的肿瘤标志物高。Kozak等[12]用SELDITOFMS技术对109例卵巢癌患者、19例卵巢良性肿瘤患者和56例健康人血清进行分析，建立了由分子量为3.1、4.5、7.8 kDa的3个蛋白标志物的诊断模型，能较好的将卵巢良性、恶性肿瘤区分开来，其准确度为88.2%，灵敏度为81.5%，特异度为94.9%。Bhattacharyya等[13]用SELDITOFMS技术和IMAC30蛋白芯片研究胰腺癌患者血清和健康人血清，69例建立模型，34例测试该模型，该模型的灵敏度为100%，特异度为93.5%。用该项技术建立的蛋白指纹图谱诊断模型的特异度及敏感度双高，有利于早期发现、早期诊断、早期治疗恶性肿瘤，降低其发病率及病死率。SELDITOFMS技术分析蛋白质产生大量的质谱数据，在数据处理中，通过离散小波分析去除噪音，用局部极值的方法找出样本质荷比峰，以10%为最小阈值对质荷比峰进行聚类。Wilcoxon秩和检验分析根据P值来评价各个峰对区分两类样本的相对重要性，将差异显著的质荷比峰随机组合输入SVM，筛选标记物，建立判别模型，用留一法交叉验证评估模型，确保所建立模型的推广性和预测的准确性。本实验使用SELDITOFMS技术结合生物信息学方法建立基于SVM的血清蛋白指纹图谱模型，成功地区分维吾尔族食管癌患者和正常人，敏感度为91.3%，特异度为93.9%，这提示该模型可从健康人群中筛检食管癌患者，对鉴别食管癌和正常人具有很好的应用价值。对2组样本数据进一步比较，发现m/z位于3 269.462 1、6 056.871 4处，食管癌组全部较正常对照组高表达，这提示其具有很大的应用价值，可进一步纯化该蛋白质，确定其性质和序列。王英等[14]采用该项技术和WCX2蛋白芯片分析199例食管鳞癌患者和106例健康人血清，建立了由12个差异蛋白组成的食管鳞癌诊断模型，该12个差异蛋白m/z分别为1 028、1 098、1 301、2 047、2 742、3 975、4 130、4 283、4 301、5 635、6 203和13 749。出现上述差异可能是由于食管癌的发生在新疆有着显著的地域性和民族差异性,即环境和遗传因素的共同影响，或可能是实验操作方法标准不统一，如样本的处理、能量分子的种类、标准蛋白质分子的校正及不同的分析软件得到的结果可能会不相同等，此外，还可能是本研究所建立的该模型样本量有限，需扩大样本量以进一步完善模型，使其具有更高的准确率和推广性。综上所述，SELDITOFMS技术结合SVM对新疆维吾尔族食管癌的诊断、差异表达蛋白质筛选方面具有较好的临床价值，值得进一步研究和应用。
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