组织因子途径抑制物1与深静脉血栓形成的研究进展

　　作者：宁亚 李文 作者单位：昆明医学院第一附属医院骨科，云南 昆明 650032

　　【关键词】 组织因子途径抑制物(TFPI)1;基因多态性;深静脉血栓(DVT);抗凝

　　深静脉血栓 (DVT) 指深静脉管腔内血液的异常凝结，常见于创伤或手术后患者，好发于下肢，若不及时发现并对其进行有效治疗，早期可因血栓栓塞局部深静脉管腔导致疼痛性股青肿，或血栓脱落继发致命性肺栓塞;晚期遗留深静脉瓣功能不全，成为严重危害患者健康的疾病之一。血液中存在一套相互拮抗的凝血和抗凝血系统，在正常情况下，通过复杂而精细的调节保持动态平衡，既维持血液在血管内呈液体流动状态，又在一旦出现血管破裂的情况下迅速在局部凝固形成止血栓，防止出血。若凝血和抗凝血过程中出现调节障碍或凝血系统在心血管内被不适当激活，从而造成血栓形成。因此，研究血栓形成的分子机制，明确其核心调控因素，找到特异、灵敏、快速早期预测诊断DVT形成的分子标记物并明确有效的药物靶点将对DVT高危患者进行更有针对性、个性化防治具有重大现实意义。组织因子途径抑制物(tissue factor pathway inhibitor，TFPI)为库尼(Kunitz)型丝氨酸蛋白酶抑制剂家族蛋白，分为TFPI1和2。但二者在基因序列、组织来源、分布及其生理作用等方面存在较大差异。TFPI1作为外源性凝血途径的特异性抑制物，在抑制血栓形成和血管重塑等方面发挥重要作用;还与炎症、动脉粥样硬化(AS)、肿瘤、败血症等疾病相关〔1〕，其重要的生理学意义和对血栓性疾病的治疗价值引人关注。本文主要综述TFPI1在DVT相关方面的研究进展。

　　1 TFPI1来源与分布

　　TFPI1主要由微血管内皮细胞合成，血管平滑肌细胞、成纤维细胞、单核/巨噬细胞、肾小球细胞、心肌细胞以及血小板、T淋巴细胞等其他细胞也有少量表达〔2〕。TFPI1在体内的分布大致分为3部分：①结合于内皮细胞腔面，占总量的50%～80%;②血液中占10%～50%，大部分与脂蛋白结合，小部分以游离形式存在;③血小板中约占8%。Dahm 等发现总TFPI1和游离型TFPI1减少是DVT的危险因素〔3〕。正常人血浆TFPI1含量为54～142 ng/ml，在体内由肝和肾负责清除，凝血酶和肝素可改变体内TFPI1分布。

　　2 TFPI1结构特点

　　2.1 基因结构

　　TFPI1的编码基因定位于2q312q32，基因全长70 kb，包括9个外显子和8个内含子。外显子1和2编码 TFPI mRNA 的5′端非翻译区，外显子3编码信号肽及N末端，外显子4、6、8分别编码TFPI的K1、K2和K3结构域，外显子5和7编码K1、K2和K3之间的两段连接区，外显子9编码C末端和3′端非翻译区。TFPI1 mRNA启动子没有典型的TATA盒和CAAT盒，而是在5′侧区的508和521胞嘧啶上有两个转录起始点〔4，5〕。

　　2.2 蛋白结构

　　TFPI1是276个氨基酸残基组成的耐热单链糖蛋白，由3个重复的Kunitz结构域(K1、K2和K3)、一个富含酸性氨基酸的N端和一个富含碱性氨基酸的C端构成。TFPI1所含18个半胱氨酸残基构成9对二硫键，参与维持其二级结构。结构域K1和K2是 TFPI 发挥抗凝活性的关键部位，分别与TF/VⅡa复合物和FⅩa发生静电相互作用，最后形成TFFVⅡaTFPIⅩa四聚体，中断外源性凝血途径级联反应〔6〕。结构域K3和C端可以和肝素、膜表面糖蛋白及多糖结合〔7〕，无直接抑制蛋白酶的功能，但它和C端对于肝素和细胞表面的结合是必需的，对TFPI1的整体抗凝活性具有重要意义，并对K2结构域结合到FⅩa上可能起定位作用〔8〕。

　　3 TFPI1生理功能

　　3.1 TFPI1与外源性凝血途径

　　1964年，MacFarlane和Davie等分别同时提出了凝血瀑布学说。随后，逐渐形成了凝血理论的传统瀑布学说，认为凝血过程由外源途径(extrinsic pathway)、内源途径(intrinsic pathway)和共同途径(common pathway)组成，其中外源性凝血途径是生理性止血的主要途径。血管内皮细胞受损时，内皮下细胞表面组织因子(TF)暴露于血液，外源性凝血途径立即启动。TF与血液中少量的FⅦ(FⅦa)结合，形成FⅦa/TF复合物，而后活化FⅩ和少量FⅨ，活化的FⅩ(FⅩa)激活凝血酶原变为凝血酶，从而引起凝血，少量FⅨa对FⅩ的激活则产生放大作用。Lu〔9〕等人通过反应动力学实验发现，生理条件下 FⅦa/TF 活化的产物中，FⅨa 的活性明显超过 FⅩa 的活性，提出外源性凝血途径的早期是以 FⅨ 活化为主，而 FⅩa 则更倾向于是FⅨa 的活化产物。

　　外源性凝血途径主要受TFPI1抑制调节，其对FVⅡa/TF复合物的抑制作用是通过两步完成：①TFPI1通过K2与活化的FⅩa结合，形成FⅩa/ TFPI1复合物，竞争性地抑制FⅩ的活性，该过程是一个 Ca2+非依赖的可逆性过程，但必须有因子Ⅹa的活性基团及TFPI1的K2抑制区的作用;②FⅩa/TFPI1 复合物中的TFPI1通过K1与FⅦa/TF复合物中的FⅦa 活性部位结合，从而实现对 FⅦa/TF 复合物的抑制。FⅩa轻链中谷氨酸残基上的γ羧基与Ca2+结合，并通过“钙桥”结合于FⅩa/FⅦa/TF复合物中TF附近的磷脂表面，使得 FⅩa/TFPI1与Ⅶa/TF形成稳固的FⅩa/TFPI1/Ⅶa/TF复合物，该复合物可以被单核细胞和内皮细胞等吞噬清除。TFPI1对VⅡa/TF的抑制反应是一种化学定量反应，并且每一步都是可逆的。TFPI的K1与K2抑制区是其发挥作用的主要位点，在抑制过程中具有重要意义。FⅩa/TFPI1复合物在外源性凝血途径活化的起始阶段对FⅦa/TF进行抑制，从而在根本上阻断FⅩ和FⅨ的大量活化，避免了凝血因子及抗凝血酶Ⅲ(ATⅢ)等抑制因子的大量消耗。由此可见，TFPI1在外源性凝血途径的负反馈调节中发挥重要作用。

　　3.2 TFPI1与肝素的抗凝作用

　　肝素是临床上应用最多的抗凝药物，其通过与ATⅢ结合，增强后者的抗凝活性而发挥间接抗凝作用〔10〕，同时还抑制凝血因子FⅨa、FⅩa、FⅪa和FⅫa的活性。Hansen等〔11〕研究结果表明，肝素可以促进培养的人血管内皮细胞TFPI1的分泌。

　　王建文等〔12〕研究结果表明，无肝素连续血液净化治疗过程中，TFPI1呈上升趋势，而使用肝素抗凝其上升幅度更为显著，且呈剂量依赖性增加，说明肝素可通过增加血管内皮细胞分泌TFPI1而增强其抗凝作用。此外免疫阻断TFPI1，肝素的抗凝效果明显下降，表明肝素的抗凝作用有赖于TFPI1。体外实验还发现，肝素和TFPI1还具有协同作用。故可以认为肝素的抗凝作用与TFPI1有密切的关系。

　　Vignoli等〔13〕研究显示，肝素可抑制炎症介质(脂多糖)诱导的内皮细胞组织因子mRNA表达量及活性。Mousa等〔14〕发现不同分子量的肝素对血浆TFPI1的影响不同，低分子量肝素可使内皮细胞TFPI1的合成和分泌增加。

　　4 TFPI1研究进展

　　4.1 TFPI1基因多态性与DVT DVT受多因素、多系统调控，调控机制复杂。是凝血抗凝、纤溶抗纤动态平衡破坏的最终结果。一方面由于体内异常凝血的复杂性，另一方面是由于缺少合适的动物模型和前沿研究手段，致使DVT的机制研究滞后。其病因和发病机制尚未清楚，但大量流行病学研究结果表明，遗传基因在DVT发病过程中可能起着重要的作用。TFPI1基因存在着基因变异及基因多态性，目前许多国内外学者试图从分子遗传学角度探讨TFPI1基因多态性是否与DVT相关，从而进一步揭示DVT的发病机制。

　　Miyata等〔15〕首次报道TFPI1 C399T(CTTTTT)转换，并认定该突变并不改变TFPI1蛋白的表达，亦与静脉血栓形成无关。Kleesiek等〔16〕发现静脉血栓形成患者P151L多态性的频率高于志愿者，认为P151L与易栓症显著相关，并与静脉血栓形成危险性有关。Amezianne等〔17〕认为内含子7CC基因型是静脉血栓形成的独立危险因素，可能是介导TFPI1水平升高的作用。Sidelmann等〔18〕临床试验结果表明，急性DVT形成患者较无血栓患者TFPI1的浓度显著升高，而此与33T/C多态性、内皮细胞炎症等无关，可能与纤维蛋白沉淀中TFPI1的释放有关。姜剑军等〔19〕采用聚合酶链反应单链构象多态性分析及DNA测序，对比了62例DVT患者和50例正常汉族人的TFPI1基因序列，认为TFPI1基因可能不是中国汉族人DVT的主要易感基因，但5号内含子中单核苷酸“G”插入有深入研究价值。刘秀娥等〔20，21〕实验结果表明，TFPI1基因C399T多态性与静脉血栓形成易感性有关，纯合突变基因型可能是静脉血栓栓塞的重要危险因素;T287c与TF启动子1208 I/D基因多态性与我国人群静脉血栓栓塞发病没有显著相关性，该基因可能不是中国汉族人的易感基因。

　　目前TFPI1基因多态性与DVT形成的关系研究仍处于初始阶段，对其是否是DVT的遗传性危险因素尚无定论，可能存在基因多态性之间的相互作用或连锁不平衡等机制，尚有待于进一步多地域、多种族、大样本量广泛深入研究，从而可能为DVT的风险预测、防治提供一条新的线索和途径。

　　4.2 重组TFPI1对DVT的防治

　　TFPI1与DVT关系密切，天然TFPI1在正常人体内含量极少、提取率很低较难获得，目前国内外已有多种生产重组TFPI1(rTFPI1)的方法，也已有相应产品面市，并陆续开展临床试验。通过动物实验已经证明，rTFPI1能明显提高或延长大鼠、小鼠、猪等感染性休克和弥散性血管内凝血(DIC)模型动物的存活率，减轻炎症反应、抑制凝血反应和防止血栓形成，减轻肺、脾、肝、肾等脏器损伤〔22，23〕。Yin等〔24〕报道，在血管壁进行TFPI1基因转移可防止局部血栓形成和狭窄而无出血危险。Chen等〔25〕通过对小鼠模型的研究，推测靶向应用rTFPI于内皮细胞，可改善全身抗凝治疗，同时尽量减少潜在出血的副作用。Holst等〔26〕证明使用重组人TFPI1161(即缺乏K3和C末端的TFPI)治疗兔颈静脉血栓时，有着与肝素同样的效力，但出血等不良反应明显减少。因此，rTFPI1有可能取代肝素应用于术后DVT的预防和治疗。Klement等〔27〕认为虽然rTFPI1等抗凝药物部分在临床试验中显示了良好的效果，但大部分仍处于动物动/静脉血栓模型阶段，抗凝血过程同时会影响到伤口愈合、炎症、血管生成、细胞分裂、凋亡等过程，所以需进一步发展和严格的审核。

　　5 展 望

　　随着分子生物学与基因工程的发展与应用，人们将会进一步了解TFPI1的抗凝作用机制，明确其基因多态性与DVT的联系，TFPI1有望作为一种简便、安全、快速、特异性和准确性高的DVT预测诊断分子标记。而安全、高效的rTFPI1药物也将研制成功并应用于临床，在测DVT的防治、降低DVT危害性、减轻传统抗凝治疗出血副作用等方面发挥积极作用，具有极大的社会效益和经济效益。

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