哺乳纲动物绵羊和大白鼠自身血红蛋白相互作用的研究及意义

　　作者：裴娟慧　秦文斌　韩丽莎　作者简介：裴娟慧(1980-)，女，在读硕士。　包头医学院血红蛋白研究室，内蒙古 包头014010

　　摘 要 目的：研究哺乳纲动物绵羊和大白鼠血红蛋白成分自身的相互作用。方法：淀粉-琼脂糖混合凝胶薄层电泳。结果：绵羊血红蛋白成分自身在“直接交叉”、“穿过”、“兜过”实验电泳过程中出现扭曲现象，大白鼠血红蛋白成分自身在“直接交叉”、“兜过”实验电泳过程中出现扭曲现象。结论：绵羊和大白鼠的血红蛋白成分可发生自身相互作用，可能与Hb亚基结构中“互作结构域”的存在有关。

　　关键词 血红蛋白;绵羊;大白鼠;相互作用

　　A Study of Interaction of Self-hemoglobin in Sheep and in Rats and Its Significance for Evolution of Species

　　PEI Juanhui，QIN Wenbin，HAN Lisha

　　(Laboratory of Hemoglobin，Baotou Medical College，Baotou 014010，China)

　　Abstract Objective：To study the interaction of self-hemoglobin in sheep and those in Rats. Methods：Cross electrophoresis of agarose-starch mixed gel was used in these experiments. Results：There was contorting phenomenon in both sheep self-hemoglobin and rat self-hemoglobin in the the course of“direct chiasma”、“crossing” and“surrounding”experimentation. Conclusion：There is interaction of self-hemoglobin component in sheep and in rats，probably relevant to“interaction domain”。

　　Key words Hemoglobin;Sheep;Rat;Interaction

　　1991年本研究室利用淀粉-琼脂糖混合凝胶电泳技术证明，在红细胞外，人血红蛋白A与血红蛋白A2可以发生相互作用[1]。随后的研究结果表明：软骨鱼系、硬骨鱼系、两栖纲动物不与人胎儿血红蛋白相互作用，而哺乳纲动物、鸟纲动物血红蛋白可以与人胎儿血红蛋白相互作用，爬行纲动物金钱龟、中华鳖Hb能与人胎儿血红蛋白相互作用，而爬行纲动物黄脊游蛇则不能[2-12]。因此指出脊椎动物Hb与人Hb相互作用的不同结果的分界线可能位于爬行纲。研究室已经研究了不同种类动物血红蛋白与人血红蛋白相互作用，但并未开展同种动物自身血红蛋白之间相互作用的研究。因此我们从生物进化角度来研究不同动物自身血红蛋白之间的相互作用，为生物进化的研究积累资料。本文利用同种动物快泳Hb兜过或穿过慢泳Hb时是否出现扭曲样的电泳图形，比较研究同种动物内部血红蛋白的微观结构差异。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料 健康绵羊，来自屠宰场，清醒状态下断头取血;Wistar大白鼠购自包头医学院动物室，3%戊巴比妥钠(1ml/kg)腹腔注射麻醉，腹主动脉穿刺抽血，3.8%肝素抗凝。

　　1.2 方法

　　1.2.1 绵羊、大白鼠溶血液的制备 取动物抗凝血0.5ml,离心(1 000rpm)3分钟，除去血浆，用生理盐水洗涤并轻轻混匀后离心，弃上清，如此反复4~5次，最后一次离心除去上清后向试管中加入压积红细胞1.5倍体积的蒸馏水和0.5倍体积的四氯化碳，剧烈震荡200次左右，使红细胞充分溶血后3 000rpm离心20分钟，上清液即为红细胞溶血液。

　　1.2.2 电泳分析 利用淀粉-琼脂糖混合凝胶薄层电泳。

　　1.2.2.1 加样方法 根据需要分为以下三种：(1)单排加样(非交叉电泳)：在凝胶玻璃板的一端距边缘2cm处并排加样，用于比较血红蛋白电泳速度的快慢;(2)交叉电泳双排加样：前排(近阳极侧)和后排(近阴极侧)为同种动物的血红蛋白，同时前后排各设一对照。前加样线长，后加样线短，后者成分穿过前者，我们称其为“穿过”;反之，称为“兜过”。(3)交叉电泳直接加样：在凝胶玻璃板的一端，两个较长加样线以“X”型交叉加样，称为“直接交叉”。

　　1.2.2.3 结果判定 (1)“直接交叉”实验中原来区带出现明显扭曲现象，为有相互作用;原来区带未出现扭曲现象，则为无相互作用。(2)“穿过”实验中被穿过的区带出现明显扭曲现象且凸向阳极者为有相互作用;未出现扭曲现象，则为无相互作用。(3)“兜过”实验中兜过区带出现明显扭曲现象且凸向阴极者为有相互作用;未出现扭曲现象，则为无相互作用。

　　2 结果

　　2.1 绵羊Hb自身相互作用

　　2.1.1 绵羊Hb“直接交叉”电泳实验 电泳电压6V/cm，电泳时间6~7h。结果发现绵羊溶血液在电泳中分为两条带，分别为绵羊HbⅠ、Ⅱ。并且电泳后出现扭曲现象，如图1。

　　图1 绵羊Hb“直接交叉”电泳结果　略

　　2.1.2 绵羊Hb“兜过”电泳实验 电泳电压6V/cm，电泳时间6~7h。结果当后排加样线的HbⅡ兜过前排加样线的HbⅠ时，HbⅡ出现了凸向阴极侧的扭曲现象，如图2。

　　图2 绵羊Hb“兜过”电泳结果　略

　　2.1.3 绵羊Hb“穿过”电泳实验 电泳电压6V/cm，电泳时间6~7h。结果当后排加样线的HbⅡ穿过前排加样的HbⅠ时，HbⅠ出现了凸向阳极侧的扭曲现象，如图3。

　　图3 绵羊Hb“穿过”电泳结果　略

　　2.2 大白鼠Hb自身相互作用 大白鼠Hb“直接交叉”、“兜过”电泳实验，电泳电压6V/cm，电泳时间4～5h。结果大白鼠溶血液在电泳中分为四条带，分别为大白鼠血红蛋白Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ。结果电泳后出现扭曲现象，如图4、图5。

　　图4 大白鼠Hb“直接交叉”电泳结果　略

　　图5 大白鼠Hb“兜过”电泳结果　略

　　3 讨论

　　Hb是体内重要的载氧色素蛋白，在体内分布十分广泛，也正是因此长期以来一直是研究各种动物之间亲缘关系及系统进化上的良好材料。Morris Godman[13]等人通过比较55种不同种属动物血红蛋白的氨基酸序列后推导出了进化树和血红蛋白的进化规律。本研究室长期以来一直进行血红蛋白的研究，并得出了血红蛋白进化的一些规律[1-12]。本文仍是从血红蛋白入手，研究同种动物内部血红蛋白的相互作用。结果表明，绵羊、大白鼠Hb成分自身发生相互作用。血红蛋白相互作用的实质是在交叉电泳过程中，不同来源的血红蛋白或血红蛋白的不同组分之间发生的一过性对称杂交，在电场的作用下，两种不同来源的血红蛋白或血红蛋白的不同组分由于电泳速度不同而相遇(或称交叉)形成临时结合的互作产物，互作产物的电泳速度介于原来两种血红蛋白或血红蛋白不同组分之间，但是二者的结合不牢固，不足以抵抗电场力作用而分离，恢复成原来的两种血红蛋白或血红蛋白的不同组分，因此互作产物中的慢泳血红蛋白就比原来的慢泳血红蛋白快泳一段，而互作产物中的快泳血红蛋白就比原来的快泳血红蛋白慢泳一段，从而形成“波浪形扭曲区带”。

　　在血红蛋白作用过程中，两种血红蛋白在电场中分别解聚生成二聚体，并通过离子键和范德华力相互连接，组成新的杂交四聚体，作用一段时间后，在电场力的作用下分开，从而出现互作区带的扭曲现象，反之，没有形成杂交四聚体则没有相互作用。在此基础上作以下推测：(1)在血红蛋白α1β2亚基接触面上存在一个“互作结构域”，此结构域在血红蛋白互作过程起关键的作用;哺乳纲、鸟纲和大部分爬行纲动物有此结构域，而小部分爬行纲动物、两栖纲、鱼纲和无腭纲无此结构域[2-12]。(2)相互作用的两种不同来源的血红蛋白或血红蛋白的不同组分必须同时含有此结构域。实验证明，绵羊、大白鼠Hb自身有相互作用，认为他们均有此结构域。鸟纲动物家鸡和爬行纲动物鳖Hb自身发生相互作用，认为它们有此结构域;而硬骨鱼纲鲤鱼和两栖类的牛蛙、鱼纲软骨鱼系动物孔鳐Hb自身不发生相互作用，认为无此结构域。(3)我们这里提出的“互作结构域”比较模糊，关于其机制还没有明确的解释，需要进一步的深入研究。

　　参考文献

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