血清IL18水平与过敏性哮喘的关系

　　作者：丁钰1,刘梦阳1,闫丽萍2,胡彬3,曲松本4,罗兵5 作者单位：(1 青岛大学医学院附属医院，山东 青岛 266003; 2 青岛市中心医院; 3 青岛市中心血站;4 青岛市第五人民医院; 5 青岛大学医学院微生物学教研室)

　　【摘要】 目的 探讨血清IL18水平及其编码基因137G/C、607C/A多态性与过敏性哮喘的相关性。方法提取受试者白细胞DNA，采用等位基因特异性引物PCR检测37例过敏性哮喘病人(哮喘组)和52例对照组IL18基因多态性;酶联免疫吸附法(ELISA)检测两组血清IL18含量。结果 哮喘组IL18基因137G/C、607C/A基因型频率和等位基因频率与对照组比较差异均无显著性(P>0.05)。哮喘组血清IL18水平明显低于对照组，差异有显著性(t=27.751，P<0.001)。哮喘组不同基因型间血清IL18水平比较差异均无显著性(P>0.05)。结论过敏性哮喘病人血清IL18水平表达降低，提示过敏性哮喘的发生可能与血清IL18水平低下有关。

　　【关键词】 白细胞介素18;基因型;基因频率;哮喘

　　RELATIONSHIP BETWEEN IL18 LEVELS AND ALLERGIC ASTHMA DING YU, LIU MENGYANG, YAN LIPING, et al(The Affiliated Hospital of Qingdao University Medical College, Qingdao 266003, China); [ABSTRACT] Objective To investigate the correlation of serum IL18 and polymorphisms of its coding genes137G/C, 607C/A with allergic asthma. Methods The DNA of white blood cells was extracted from the subjects. The polymorphism of the IL18 gene in 37 asthmatic patients and 52 healthy controls were detected by allelespecific primers PCR (pcrssp). The level of serum IL18 was measured by ELISA. Results There was no differences in the IL18 genetypes and allele at 607 and 137 between asthma group and the control (P>0.05). The serum IL18 in asthma group was significantly lower than that in the control (t=27.751,P<0.001), but the difference of serum IL18 between different genotypes in asthma group was not significant (P>0.05). Conclusion Low serum levels of IL18 were seen in patients with allergic asthma, which indicates that the development of the disease is probably associated with low IL18.

　　[KEY WORDS] interleukin18; genotype; gene frequency; asthma

　　过敏性哮喘(简称哮喘)是由多种细胞特别是肥大细胞、嗜酸性粒细胞和T淋巴细胞参与的慢性气道炎症性疾病。我国哮喘的患病率约为1%，儿童可达3%，近年来随着其患病率和病死率逐步上升，哮喘已成为严重威胁公众健康的主要慢性疾病之一[12]。青岛地区因其高湿度、高盐分的独特气候和居民喜食海鲜的饮食习惯，已成为我国过敏性疾病高发区。哮喘发病受遗传、环境等多重因素的影响，多数学者认为细胞因子在哮喘的发病过程中起着重要作用。本文对哮喘病人IL18基因137和607位点多态性以及血清IL18水平进行检测，探讨其与哮喘发病的相关性。现将结果报告如下。

　　1 对象与方法

　　1.1 研究对象

　　哮喘组病人37例，男18例，女19例;平均年龄(27±7)岁;哮喘诊断均符合中华医学会呼吸病学分会哮喘学组2003年制定的诊断标准。对照组52例，男25例，女27例;平均年龄(26±8)岁，均为健康查体者，排除有过敏反应家族史和个人过敏史者。两组年龄和性别比较均无显著性差异。

　　1.2 DNA制备

　　采集受试者空腹静脉血5 mL至EDTAK2抗凝管中，颠倒混匀。离心后提取下层血浆和白细胞层约1 mL移入高压灭菌的离心管中，采用酚氯仿异戊醇法抽提细胞DNA。将细胞DNA沉淀移入1.5 mL的EP管中，12 000 r/min离心10 min，弃去上清液，沉淀自然干燥后，加无菌纯水充分溶解，置4 ℃冰箱保存备用。

　　1.3 PCR检测

　　参考文献[3]设计IL18基因607位点的特异性引物，2条特异性正向引物序列分别为5′GTTGCAGAAAGTGTAAAAATTATTAC3′和5′GTTGCAGAAAGTGTAAAAATTATTAA3′，共同反向引物序列为5′TAACCTCATTCAGGACT3′，　质控正向引物序列为5′CTTTGCTATCATTCCAG3′。IL18基因137位点2条特异性正向引物序列分别为5′CCCCAACTTTTACGGAAGAAAAG3′和5′CCCCAACTTTTACGGAAGAAAAC3′,共同反向引物序列为5′AGGAGGGCAAAATGCACTGG3′，质控正向引物序列为5′CCAATAGGACTGATTATTCCGCA3′。IL18基因607位点的PCR总体系为25 μL，包括10×PCR缓冲液2.5 μL(含2.0 mmol/L MgCl2)，0.25 mmol/L dNTP，约30 ng的基因组DNA和1 U的Taq聚合酶。质控正向引物0.4 μmol/L，特异性正向引物0.4 μmol/L，共同反向引物0.8 μmol/L。扩增参数：首先94 ℃预变性4 min;然后94 ℃变性20 s，62 ℃退火40 s，72 ℃延伸40 s，共进行7个循环;随后94 ℃变性20 s，55 ℃退火40 s，72 ℃延伸40 s，共进行35个循环。取2条特异性正向引物分别扩增的PCR产物于20 g/L的琼脂糖凝胶上电泳，电压80 V，40 min，溴化乙锭染色，紫外线凝胶成像系统观察结果并鉴定基因型。

　　IL18基因137位点的PCR总体系为25 μL，包括10×PCR缓冲液2.5 μL(含有2.0 mmol/L MgCl2)，0.2 mmol/L dNTP，约30 ng基因组DNA和1 U Taq聚合酶。质控正向引物0.5 μmol/L，一种特异性正向引物0.5 μmol/L，共同反向引物1.0 μmol/L。扩增参数：首先94 ℃预变性2 min;然后94 ℃变性20 s，68 ℃退火60 s，共进行5个循环;随后94 ℃变性20 s，62 ℃退火20 s，72 ℃延伸40 s，共进行25个循环。取2条特异性正向引物分别扩增的PCR产物于20 g/L的琼脂糖凝胶上电泳，电压80 V，40 min，溴化乙锭染色，紫外线凝胶成像系统观察结果并鉴定基因型。

　　2 结 果

　　2.1 IL18基因607位点多态性检测

　　每份标本分别用2条特异性正向引物做2管PCR，301 bp处为质控条带，196 bp处为A/C等位基因特异性扩增片段。部分标本IL18基因607位点多态性检测结果见图1。标本①和②只有C等位基因处可观察到长196 bp特异性扩增片段，所以其基因型为CC;标本③和④的②管PCR产物电泳后均可观察到长196 bp特异性扩增片段，故其基因型为CA;标本⑤只有在A等位基因处可观察到长196 bp特异性扩增片段，其基因型则为AA。

　　2.2 IL18基因137位点多态性的电泳

　　每份标本分别用2条特异性正向引物做2管PCR，图2为部分标本IL18基因137位点多态性检测电泳结果，446 bp处为质控条带，261 bp处为G/C等位基因特异性扩增片段。标本②、④和⑤只有G等位基因处可观察到长261 bp特异性扩增片段，所以其基因型为GG;标本③的2管PCR产物电泳后均可观察到长261 bp特异性扩增片段，故其基因型为GC;标本⑥只有C等位基因处可观察到长261 bp特异性扩增片段，其基因型则为CC。

　　M：标准参照物，①、②为CC基因型，③、④为CA基因型，⑤为AA基因型。

　　图1 IL18基因607C/A位点多态性电泳图

　　M：标准参照物，①为阴性对照，②、④和⑤为GG基因型，③为GC基因型，⑥为CC基因型。

　　图2 IL18基因137G/C位点多态性电泳图

　　2.3 IL18基因607位点基因型频率和等位基因频率的比较

　　两组IL18基因607位点基因型频率和等位基因频率比较差异无显著性(P>0.05)。见表1。

　　2.4 IL18基因137位点基因型频率和等位基因频率的比较

　　两组IL18基因137位点基因型频率和等位基因频率比较差异无显著性(P>0.05)。见表2。

　　2.5 IL18血清水平的比较

　　哮喘组病人和对照组血清IL18的水平分别为(48.844±11.193)和(476.799±93.174)ng/L，哮喘组血清IL18水平明显低于对照组，差异有显著性(t=27.751，P<0.001)。

　　2.6 不同IL18基因型哮喘病人血清IL18水平的比较

　　哮喘组IL18基因607位点CC、CA、AA基因型病人血清IL18水平分别为(51.412±13.564)、(50.229±10.679)和(42.980±9.325)ng/L，IL18基因137位点GG、GC、CC基因型病人血清IL18水平分别为(49.068±12.432)、(48.772±7.597)和(43.458±0.000)ng/L，不同基因型间血清IL18水平比较均差异无显著性(P>0.05)。

　　表1 IL18基因607位点多态性分布比较(例(χ%))组别n基因型频率CCCAAA等位基因频率CA对照组5213(25.0)28(53.8)11(21.2)54(51.9)50(48.1)哮喘组379(24.3)20(54.1)8(21.6)38(51.4)36(48.6)

　　表2 IL18基因137位点多态性分布比较(例(χ/%))组别n基因型频率GGGCCC等位基因频率GC对照组5238(73.1)13(25.0)1(1.9)89(85.6)15(14.4)哮喘组3727(73.0)9(24.3)1(2.7)63(85.1)11(14.9)

　　3 讨 论

　　目前认为，哮喘的发病机制与Th1/Th2细胞释放的细胞因子不平衡相关，研究证实，许多Th2类细胞因子如IL4、IL13等在哮喘病人血清中高表达，而Th1类细胞因子如IL2、IL12等表达则明显减弱。IL18是近来发现的一种新的细胞因子，大多数研究结果认为该因子能降低气道高反应性，对哮喘气道炎症中的嗜酸性粒细胞也有重要调节作用。HOFSTRA等[4]研究结果显示，吸入卵白蛋白(OVA)致敏小鼠血清IgE水平升高，气道反应性增高，支气管灌洗液中嗜酸性粒细胞明显增多。然后将小鼠分为IL18治疗组、IL12治疗组和IL18加IL12共同治疗组，连续治疗3周，观察到单用IL18或IL12对小鼠血清IgE水平、气道高反应性和气道嗜酸性粒细胞浸润等过敏表现无显著影响，但IL18和IL12两者合用则对上述过敏表现产生明显抑制作用，尤其是血清IgE水平完全恢复到正常对照组水平，提示IL12和IL18可在体内协同作用阻止Th2细胞分化，从而抑制变应性哮喘的发生。KODAMA等[5]利用IL18基因敲除小鼠探讨了IL18对气道黏膜免疫的诱导和维持作用，以及腹腔内注射IL18对缺乏IL18小鼠气道黏膜下T细胞免疫的作用，结果提示IL18缺乏小鼠肺内嗜酸性粒细胞明显高于对照组的野生鼠，而腹腔内注射重组IL18则可将这些变化降低到与对照组一样的水平。也有研究表明，IL18可以调节B细胞免疫球蛋白的分泌，抑制活化的B细胞产生IgE，从而降低气道的高反应性，抑制气道炎症[67]。然而，最近也有动物实验表明，IL18有更为多向性的复杂作用，其在哮喘中的具体作用仍存在争议。WILD等[8]研究显示，在小鼠过敏性哮喘模型中，鼻内注入IL18和豚草可增加豚草特异性IgE、IgG1和支气管肺泡灌洗液中嗜酸性粒细胞的水平，而且小鼠肺内注入IL18与气道中嗜酸性粒细胞活化趋化细胞因子的增加、嗜酸性粒细胞的招募有关，因此IL18可能通过募集嗜酸性粒细胞和刺激IgE的产生来引发过敏性炎症。进一步研究表明，高水平IL18可上调特异性IgE生成及激活Th2细胞产生Th2细胞因子(IL4和IL13等)，其含量随变应性疾病炎症的加重有增高的趋势，并与变应性炎症的持续存在有关。KUMANO等[9]研究显示，IL18可促进抗原诱导的嗜酸性粒细胞在气道中的募集，注射IL18对这种抗原诱导的嗜酸性粒细胞募集有剂量依赖关系，抗TNFα抗体可部分防止抗原诱导的致敏小鼠气道黏膜嗜酸性粒细胞的募集，实验提示IL18促进气道嗜酸性粒细胞的募集部分是通过增加致敏动物抗原诱导的CD4+T细胞产生TNFα实现的，即IL18可直接或间接促进和加重哮喘的气道炎症。李燕等[10]研究显示，哮喘病人的血清IL18水平较正常人升高，且与IL13增高水平呈正相关，因此他们认为IL18可加强Th2细胞免疫应答，从而导致Th1/Th2免疫失衡，促使哮喘发生。汪玲等[11]研究也显示，哮喘病人血清IL18浓度高于健康对照组，提示IL18参与哮喘发病的免疫机制。本文结果显示，哮喘组血清IL18水平明显低于对照组，提示过敏性哮喘的发生可能与本身血清IL18水平低下有关，血清IL18表达降低可能参与促进过敏反应的发生，与HO等[12]研究结果相吻合。

　　有证据表明，IL18基因启动子区单核苷酸多态性(SNP)可影响IL18的产生，近几年有诸多IL18基因SNP与疾病关系的研究报道。IMBODEN等[13]报道了瑞士人群中IL18基因启动子1137等位基因和过敏性哮喘有关，并且认为IL18基因变异是过敏性哮喘的重要遗传决定因素。IL18基因137(G/C)位于GATA3结合位点，GATA3被认为主要诱导广泛的特异性Th2表型。PAWLIK等[14]对波兰人群的最新研究结果表明，IL18基因启动子、137G等位基因和CG/GG基因型可能与重度哮喘的发病有关。杨慧等[15]对102例哮喘病人IL18基因多态性与江西汉族人群哮喘的关系进行了初步研究，未检出IL18基因启动子1137G等位基因和过敏性哮喘有关，而检出IL18基因137C等位基因与江西汉族人群哮喘并过敏性鼻炎有关，IL18基因607C/A、137G/C基因多态性频率分布在哮喘合并过敏性鼻炎与哮喘不合并过敏性鼻炎病人中不同，提示IL18可能在哮喘和过敏性鼻炎发病机制中所起的作用不同。本研究对IL18编码基因607C/A、137G/C多态性的分析结果表明，两个位点基因型频率和等位基因频率在哮喘组和对照组之间差异均无显著意义，未得出IL18编码基因607C/A、137G/C多态性与过敏性哮喘相关的结论;同时对不同基因型间血清IL18的水平进行统计学分析，也未得出基因多态性可影响IL18血清水平的结论，推测可能与样本大小、种族差异、地域差异以及遗传因素和环境因素之间存在着复杂的相互作用等原因有关。

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