三氧化二砷对人胃癌裸鼠移植瘤血管生成素2和血管内皮生长因子表达的影响

　　作者：肖延风，刘陕西，邬德东，陈玺，任利芬 作者单位：西安交通大学医学院：1. 第二附属医院儿科，陕西西安 710004;2. 第一附属医院血液科，陕西西安 710061

　　【摘要】 目的 研究三氧化二砷(As2O3)对肿瘤血管生成素2(Ang2)和血管内皮生长因子(VEGF)表达的影响。方法 用人胃腺癌细胞株SGC7901接种30只裸鼠皮下，建立实体瘤模型;然后随机分为As2O3高剂量(5mg/kg)、低剂量(2.5mg/kg)治疗组和对照组，每组各10只。治疗组接受As2O3腹腔注射10d，对照组注射生理盐水。测量肿瘤体积并计算抑瘤率;免疫荧光标记CD31并计算血管密度;免疫组化方法测定Ang2的表达;免疫荧光激光共聚焦检测VEGF的表达。结果 砷剂治疗可抑制瘤块生长，2.5mg/kg和5mg/kg As2O3治疗组的抑瘤率分别为30.33%和50.85%。As2O3治疗组的微血管密度(MVD)、VEGF荧光表达水平均显著低于对照组(P<0.01)。Ang2主要在血管内皮细胞的胞浆中呈强阳性表达，可清晰标记肿瘤内的血管;对照组和As2O3治疗组血管内皮细胞Ang2表达强度无明显差异。结论 As2O3对Ang2表达无明显影响，在As2O3治疗抑制瘤细胞VEGF表达的情况下，Ang2表达可促进血管的退化。Ang2主要在新生的内皮细胞表达，故可能作为新生血管的标记物，成为肿瘤新生血管研究的新指标。

　　【关键词】 三氧化二砷;血管生成素2;血管内皮生长因子;血管生成;胃癌;血管密度

　　in human gastric cancer transplanted in nude miceXIAO Yanfeng1, LIU Shaanxi2, WU Dedong1, CHEN Xi1, REN Lifen1

　　(1. Department of Pediatrics, the Second Affiliated Hospital, Medical School of

　　Xian Jiaotong University, Xian 710004; 2. Department of Hematology, the First Affiliated

　　Hospital, Medical School of Xian Jioatong University, Xian 710061, China)ABSTRACT: Objective To investigate the effect of arsenic trioxide (As2O3) on expression of angiopoietin2 and vascular endothelial growth factor (VEGF) in cancer. Methods The solid tumor model was formed in nude mice with gastric cancer cell line SGC7901. The 30 nude mice were randomly divided into the two arsenictreated groups (2.5mg/kg and 5mg/kg) and control group. As2O3 was injected to mice in the treated groups for 10 days; the same volume of saline solution was injected to the control group. The volume of gastric tumor xenografts was measured and counted for tumor growth inhibition (TGI). Microvessel density (MVD) labeled by CD31 was measured with immunofluorescence. Expression of angiopoietin2 was detected by immunohistochemistry, and expression of VEGF was detected by immunofluorescence laser confocal technology. Results Tumor growth inhibitions were 30.33% and 50.85% in 2.5mg/kg and 5mg/kg As2O3, respectively. Decrease of MVD appeared in As2O3treated tumors compared with that in the control group. The fluorescence intensity level of VEGF in tumor cells was lower significantly than that in the arsenictreated groups. Angiopoietin2 was mostly expressed in endothelial cells in tumors. There was no difference in expression level of angiopoeitin2 between arsenictreated groups and the control group. Conclusion As2O3 does not affect the expression of angiopoietin2. Angiopoietin2 may induce vessel regression, and VEGF expression is decreased by As2O3 in tumor. Angiopoietin2 may become a new indicator in study on angiogenesis in tumor.

　　KEY WORDS: arsenic trioxide; angiopoietin2; vascular endothelial growth factor; angiogenesis; gastric cancer; microvessel density

　　有多种细胞因子通过不同的受体参与血管生成过程，其中特异性作用于内皮细胞的细胞因子有两类：血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)和血管生成素(angiopoietin, Ang)。VEGF促进内皮细胞增殖，而Ang则支持细胞的募集。Ang与VEGF 协同作用，参与调节新生血管生成。Ang家族是唯一含受体激动剂及抑制剂的促血管生成因子，目前发现4个成员，其中Ang1和Ang2已经被证实与肿瘤血管生成关系密切，而Ang3和Ang4与肿瘤血管新生的相关研究较少。目前，研究认为Ang1的表达与肿瘤血管形成的多少关系不大;而Ang2表达是肿瘤血管新生起始及加强的因素，与肿瘤血管形成数目、临床分期及预后关系密切[12]。Ang2和VEGF对肿瘤血管新生均起重要作用，而Ang2对血管的调节呈VEGF依赖性。

　　砷是一种氮族金属元素，以3价或5价形式广泛存在。砷化物砒霜(主要成分为As2O3)作为中药使用已有上千年历史，用于肿瘤治疗也有几百年的历史。我国学者首先用As2O3治疗急性粒细胞白血病获得显著疗效。近年来，已发现As2O3对肿瘤血管生成有抑制作用。本研究建立人胃腺癌裸鼠移植瘤模型，采用As2O3腹腔注射治疗，观察瘤组织中Ang2和VEGF的表达情况，旨在探讨As2O3对肿瘤Ang2和VEGF表达的影响，以阐明As2O3抑制肿瘤血管生成的作用机制。

　　1 材料与方法

　　1.1 动物模型的建立 裸鼠30只，雄性，5周龄，体重19～21g，于第四军医大学实验动物中心SPF动物实验室饲养。人胃腺癌株SGC7901细胞常规培养至对数生长期(10d)，用RPMI1640调整细胞密度至2×107/mL;取该细胞悬液0.2mL(4×106个SGC7901细胞/只)接种于每只裸鼠右后肢背部皮下。

　　1.2 实验分组和药物干预 裸鼠接种SGC7901细胞后，隔天观察一次，瘤块变硬，且长径大于0.5cm视为成瘤。于接种肿瘤细胞第10天，观察每只裸鼠均形成瘤节。于接种肿瘤细胞第11天按随机分组的原则将30只裸鼠分为As2O3低剂量治疗组(2.5mg/kg组)、高剂量治疗组(5mg/kg组)和对照组。分别腹腔注射As2O3 2.5mg/kg、5mg/kg及生理盐水0.2mL，每天1次、连续给药10d。

　　1.3 取材及固定 于末次给药次日(即治疗第11天)，腹腔注射戊巴比妥钠进行麻醉，迅速取下瘤块并称重后放入40g/L多聚甲醛溶液中固定，供制备冰冻切片和石蜡切片用。另外，取肝肾组织制备石蜡切片，HE染色，观察组织形态学变化。

　　1.4 抑瘤率(tumor growth inhibition, TGI)的计算 于治疗开始前、治疗第6天、第11天分别测量瘤块的长径(a)、短径(b)，瘤块体积(mm3)=ab2/2，抑瘤率=(1-治疗组平均瘤块体积/对照组平均瘤块体积)×100%。

　　1.5 血管生成素2表达的检测 采用免疫组化法，步骤如下：①脱蜡、脱水，取出制备好的石蜡切片在以下液体中浸泡：二甲苯15min→二甲苯15min→无水乙醇10min→95%(体积分数)乙醇10min→80%(体积分数)乙醇10min;②纯水浸泡，2×5min;③滴加H2O2，置湿盒中室温下孵育10min;④纯水冲洗，PBS浸泡5min;⑤滴加山羊血清，37℃下孵育20min，倾去，勿洗;⑥滴加一抗，为兔抗人Ang2多克隆抗体(美国Santa Cruz生产)，37℃条件下孵育3h;⑦PBS冲洗，3×5min;⑧滴加羊抗兔IgG，37℃条件下孵育15min;⑨PBS冲洗，3×5min;⑩滴加过氧化酶标记的辣酶卵白素工作液，37℃条件下孵育15min;PBS冲洗，3×5min;显色剂(DAB)显色10min;自来水冲洗，浸泡2×5min;脱水、透明，将以上玻片分别在以下液体中浸泡：80%(体积分数)乙醇5min→95%(体积分数)乙醇5min→无水乙醇10min→无水乙醇10min→二甲苯10min→二甲苯10min;封片：将中性树胶滴于载玻片上，缓慢放下盖玻片封片。将制作好的玻片置于光镜下，在400倍和1000倍下观察结果，在血管热点区取图，摄像。

　　1.6 CD31和VEGF表达的检测 采用免疫荧光法，步骤如下：①取出已经用40g/L多聚甲醛固定好的冰冻切片，置于室温下30min，然后蒸馏水浸泡5min，PBS浸泡5min;②1g/LTritonX100打孔10min;③PBS冲洗3×5min;④滴加封闭血清，37℃条件下孵育20min，倾去，勿洗;⑤分别滴加稀释的一抗[兔抗人VEGF多克隆抗体(Labvision, USA)];大鼠抗小鼠CD31一抗(Biolegend, USA)4℃过夜;⑥PBS冲洗3×5min;⑦分别滴加FITC标记的绵羊抗兔荧光二抗(Sigma)和TRITC标记的羊抗大鼠荧光二抗(Sigma)，37℃条件下反应1h;⑧PBS冲洗3×10min;⑨甘油封片。

　　1.7 激光共聚焦分析 用激光共聚焦显微镜(TCS SP2，德国Leica)，450～500nm波长激发，515～565nm波长观察结果。在每个肿瘤标本上取10个图像，用LeiCa Confoncal图片处理软件进行荧光强度分析，取均值表示该标本的荧光强度。

　　1.8 血管计数 在荧光显微镜(德国ZEISS)下观察结果。能被CD31荧光着色且分界清楚、并能与临床血管、肿瘤细胞及其他结缔组织区分的内皮细胞作为单个计数微血管。选择微血管热点区(neovascular hot spot)，光镜40倍视野下选择20个计数其内微血管数，取平均数即为微血管密度。

　　1.9 统计学处理 使用SPSS13.0软件处理数据，计量资料采用均数±标准差(±s)表示。多样本均数比较采用完全随机设计的单因素方差分析，各组均数间的两两比较用StudentNewmanKewls法。以P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 As2O3对肿瘤生长的抑制作用 As2O3治疗后肿瘤体积明显减小，2.5mg/kg组和5mg/kg组的抑瘤率分别为30.33%和50.85%(表1)。肝肾组织HE染色示与对照组相比，治疗组裸鼠的肝、肾组织没有明显的病理改变。

　　2.2 As2O3对肿瘤血管密度和VEGF表达的影响 治疗后肿瘤血管密度显著减少，5mg/kg组的血管密度也明显低于2.5mg/kg组，差异有统计学意义(P<0.01)。对照组肿瘤细胞的VEGF呈较强荧光表达。荧光强度激光共聚焦分析显示，对照组高于治疗组，2.5mg/kg组高于5mg/kg组，其差异有显著性意义(表2、图1)。表1 三组肿瘤生长抑瘤率的比较表2 三组MVD和VEGF表达的比较

　　2.3 Ang2的表达以及As2O3对其表达的影响 镜下观察发现，在人胃腺癌组织中Ang2主要在血管内皮细胞表达。血管内皮细胞的胞浆和胞膜可见密集黄棕色颗粒，呈强阳性表达;极少部分瘤细胞胞浆内可见少量黄色细颗粒状表达，呈弱表达。在瘤组织周边血管热点区域清楚可见Ang2表达标记的肿瘤血管(图2)。对照组(图2C)的血管比较丰富，As2O3治疗组的血管数明显减少，高剂量组(图2A)的血管明显比低剂量组(图2B)减少。对照组和As2O3治疗组血管内皮细胞Ang2表达均较强，未发现表达强度的区别，说明As2O3对内皮细胞Ang2表达本身影响不显著。

　　3 讨 论

　　本研究的结果显示，As2O3按2.5mg/kg和5mg/kg剂量给药10d，抑瘤率分别达29.08%和52.17%。可见As2O3单剂能显著抑制人胃癌裸鼠皮下移植瘤的生长，并且没有引起裸鼠肝、肾组织的病理损害。目前，多数研究认为MVD可以作为预测肿瘤复发转移、生存率的一项预后指标，也可作为恶性肿瘤的鉴别诊断指标[3]。因此，抑制肿瘤血管新生成为倍受关注的抗肿瘤治疗研究方向。本研究以人胃腺癌SGC7901细胞建立裸鼠皮下移植瘤，采用CD31免疫荧光标记检测MVD，高、低剂量As2O3治疗组瘤组织内微血管密度比对照组显著减低，高剂量组MVD明显低于低剂量组者，进一步证明As2O3能抑制肿瘤血管的新生。

　　VEGF表达与血管生成和增殖反应明显相关，与肿瘤的微血管密度正相关。有研究表明瘤内VEGF阳性表达时瘤区内皮细胞比非瘤区多7倍[4]。其表达与病理分级有关，随肿瘤恶性程度增加表达增强，还与肿瘤的转移、复发、预后关系密切。许多实验证实肿瘤组织内的VEGF表达与微血管密度、恶性程度和转移情况呈正相关[5]。本研究治疗组裸鼠经过高、低剂量As2O3腹腔注射治疗后，在瘤块生长减慢、瘤组织中血管密度减少的同时，瘤细胞的VEGF表达显著减弱，并呈剂量依赖性。表明As2O3可体内抑制胃癌细胞VEGF的表达，这可能是瘤组织血管生长受抑、血管密度变少的重要原因之一。

　　Ang2在生理状况下主要表达于成年女性的生殖系统，如卵巢、子宫内膜、胎盘，参与生理性血管修复、重建;在病理状况下，Ang2主要表达于肿瘤、炎症、创伤等部位，参与病理血管的形成、重建，且以新生血管网的前沿最为丰富[6]。Ang2在转移性的黑色素瘤、乳腺癌、前列腺癌、肺癌、胃癌和直肠癌等的肿瘤性血管内皮细胞上的表达明显高于正常组织[7]，并且Ang2的表达与病理分期、肿瘤转移及预后密切相关[8]。本研究采用免疫组化方法检测了人胃腺癌裸鼠移植瘤的Ang2表达。结果发现，Ang2主要在血管内皮细胞内呈强阳性表达，肿瘤细胞无明显表达。由Ang2标记的血管在瘤块外周接近正常组织区比较密集，与CD31标记的血管位置和数量一致。因此，认为Ang2可以作为新生血管的标记物，成为肿瘤新生血管研究的新指标。

　　Ang2对血管生成的作用与VEGF密切相关，相关研究较多。LOBOV等[9]用眼前房微血管网研究Ang2与血管生成的关系，发现当VEGF的作用受抑制时，Ang2促进内皮细胞的凋亡，导致血管的退化。在VEGF存在时，Ang2促进血管生成。血管内皮细胞表达Ang2是血管生成的早期信号，Ang2能拮抗Ang1活化Tie2的作用，抑制内皮细胞与细胞外基质、平滑肌细胞、管周细胞等支持细胞间的相互作用，使血管不能发育成熟，底膜缺损，结构不稳定，随后VEGF的表达增加，一方面抵消Ang2的血管退化作用，另一方面促进这些不稳定的血管生长。因此，Ang2的作用主要是阻止血管的分化成熟，使肿瘤血管保持稀薄有漏洞的形态，有助于VEGF作用的发挥，使肿瘤进一步发展。YOSHIJI等[10]在鼠类肝癌研究中发现，单独Ang2过表达不引起肿瘤增殖，Ang2和VEGF共表达时，协同性促进肿瘤生长和肿瘤血管生成。当VEGF缺乏时，Ang2的表达主要使血管发生退化、血管数目减少，同时伴内皮细胞凋亡，αSMA断裂。

　　本研究建立裸鼠实体瘤模型，给予高、低剂量As2O3治疗。结果显示，治疗后肿瘤生长明显受抑制;血管密度减低;瘤细胞VEGF的表达明显减低;Ang2表达的血管内皮细胞的数量明显减少。但是，治疗组和对照组血管内皮细胞Ang2表达强度无明显差异，均呈强阳性表达。As2O3治疗后瘤细胞VEGF的表达受到抑制，而Ang2的表达未受As2O3影响。

　　本研究提示，As2O3对Ang2表达无明显影响，在As2O3治疗抑制瘤细胞VEGF的表达情况下，Ang2表达可促进血管的退化。As2O3抑制肿瘤血管生成的机制中除了VEGF分泌减少的直接作用外，还与 Ang2促进肿瘤血管退化作用有关。此外，Ang2主要在新生的内皮细胞表达，故可能作为新生血管的标记物，成为肿瘤新生血管研究的新指标。

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