网织血小板检测方法的改良及临床应用

　　作者：曹永献，吴春梅，卢伟 　(青岛大学医学院附属医院临床免疫检验中心，山东 青岛 266003; 青岛大学医学院血液学教研室)

　　[摘要]目的 改良网织血小板(RP)检测方法并探讨其临床应用价值。方法 以噻唑橙(TO)作为RNA的荧光染料，利用流式细胞仪检测30例正常人(正常对照组)和48例各种血小板减少症外周血中含有RNA的RP百分数及RP绝对值，后者包括原发性血小板减少性紫癜(ITP)、再生障碍性贫血病人(AA)及初治急性白血病病人。结果 ITP病人RP百分数明显高于正常对照组( F=65.29，q=10.26，P <0.01)，而RP绝对值明显低于正常对照组( F=85.07，q=19.59，P <0.01);AA病人RP百分数及绝对值均低于正常对照组( q=3.47、16.41，P <0.05、 0.01 );AL组病人RP百分数与正常对照组比较无明显差异( q=0.51，P >0.05)，但其RP绝对值明显低于正常对照组( q=15.46，P <0.01)。结论 改良了传统的网织血小板检测方法并建立了简便、稳定的检测手段，为临床各类血小板减少性疾病的诊断提供了可靠的方法。

　　[关键词] 血小板减少; 网织血小板; 流式细胞术

　　IMPROVEMENT AND CLINICAL APPLICATION OF RETICULATED PLATELET DETECTION

　　CAO YONG-XIAN， WU CHUN-MEI， LU WEI

　　(Clinical Immunology Center， The Affiliated Hospital of Qingdao University Medical College， Qingdao 266003， China)

　　[ABSTRACT]ObjectiveTo improve the measurement of reticulated platelets (RPs) and to explore its clinical application. MethodsUsing thiazole orange as a fluorescent dye， RPs were measured by analyzing the RNA content in platelets in 30 normal controls and 48 various thrombocytopenia， i.e. idiopathic thrombocytopenic purpura (ITP)， aplastic anemia (AA)， and initially-treated acute leukemia (AL)， with flow cytometry. The percentage and absolute value of RPs were calculated. ResultsCom-pared with the normal group， ITP patients had a significantly high percentage ( F=65.29，q=10.26，P< 0.01) and low absolute value of RPs ( F=85.07，q=19.59，P <0.01); in AA， both the percentage and absolute value of RPs were at low levels ( q=3.47，16.41; P <0.05，0.01). There was no difference of RP percentage between the AL and normal controls ( q= 0.51， P >0.05)， but the absolute value of RPs in AL was significantly lower than the control ( q=15.46， P <0.01). ConclusionThe traditional method of reticulated platelet detection has been improved and a simple and stable one established， which provides a reliable method for diagnosis of various thrombocytopenia.

　　[KEY WORDS]thrombocytopenia; reticulated platelet; flow cytometry

　　网织血小板(RP)与网织红细胞一样都是刚从骨髓中释放出来的未成熟细胞[1]，RP与正常血小板相比胞浆内含有少量mRNA，体积较大，而且有更强的活性[2]。随着血小板的成熟，胞浆内mRNA逐渐消失，体积逐渐变小。测定外周血RP可以比较精确地反映骨髓血小板生成情况。荧光染料噻唑橙(TO)可以直接穿过细胞膜进入胞浆，当它与RNA结合后，其发射荧光强度的能力可增大3 000倍。我们对检测方法进行了改良并探讨外周血RP数值的变化在各型血小板减少性疾病中的诊断价值，现将结果报告如下。

　　1 资料与方法

　　1.1 研究对象 我院2003～2004年住院血液病病人48例，其中特发性血小板减少性紫癜(ITP)21例，再生障碍性贫血(AA)15例，白血病初治病人(AL)12例，诊断均符合《血液病诊断及疗效标准》[3]。正常对照组为正常健康人30例，为我院门诊体检者，男14例，女16例;年龄16～72岁;血小板计数(100～300)×109 /L。

　　1.2 试剂与仪器 TO购自美国Sigma公司，CD41-PE试剂盒为法国Immuno-teach产品。EPICSXL型流式细胞仪为Coulter公司生产，应用SYSTEM Ⅱ Software获取和分析试验数据，鞘液使用ISOTON Ⅲ稀释液。Coulter-ONYX型血细胞计数仪为美国Coul-ter公司生产。

　　1.3 富血小板血浆(PRP)制备及标记 采病人静脉血2 mL，500 r/min离心5 min，取上清，加入TES，2 000 r/min离心10 min，弃上清，制成PRP。取FCM专用试管两支，每支试管中加入15 μL PRP，50 μL PBS和 10 μL CD41-PE单抗，标记血小板，漩涡混匀后室温避光孵育20 min后，分别在对照管中加入1 mL PBS，测定管中加入TO试剂(20 μg/L)1 mL，再次室温孵育30 min。

　　1.4 检测方法改良 由于使用的TO试剂的浓度和孵育时间及设定的Mark(阴阳性的界线)的不同，对检测的结果有很大的影响，故对TO试剂进行了一系列不同浓度的稀释，并进行了检测标本的比较，以确定TO试剂的测定的最佳浓度。将TO溶于甲醇，使其终浓度为1 g/L，-20 ℃保存作为储存液备用，PBS配成浓度为20 μg/L应用液，可保存1周，结果稳定。参照MATIC等[4]描述的设门策略识别网织血小板，FSLOG为 X 轴，对数CD41-PE为 Y 轴，设CD41阳性细胞为A门，另开一窗以SSLOG为 X 轴，对数(TO-Retic)为 Y 轴，对A门中的血小板进行分析，以自身血小板为阴性对照，沿血小板实际点图上缘设立界值，使其RP百分数在1%以下，检测标本与自身对照试验条件完全一致。流式细胞仪检测20 000个血小板，RP结果以百分数表示，RP绝对值为血小板数乘以RP百分数。

　　1.5 统计学处理 所得数据均以 x±s 表示，组间比较采用完全随机设计资料的方差分析。

　　2 结果

　　正常对照组、ITP组、AA组、AL组RP绝对值分别为(18.16±6.60)×109 /L、(8.98±3.09)×109 /L、(1.84±0.75)×109 /L、(1.54±0.48)×109 /L，RP百分数分别为(7.38±3.51)%、(7.38± 3.51 )%、( 4.71± 1.32)%、(6.51±1.47)%。ITP病人RP百分数明显高于正常对照组( F=65.29， q= 10.26，P <0.01)，而RP绝对值明显低于正常对照组( F= 85.07，q=19.59，P <0.01);AA病人RP百分数及绝对值均低于正常对照组( q=3.47、 16.41 ， P < 0.05、0.01);AL组病人RP百分数与正常对照组比较无明显差异( q=0.51，P >0.05)，但其RP绝对值明显低于正常对照组( q=15.46，P <0.01)。

　　3 讨论

　　由于RP是刚从骨髓释放出来的未成熟血小板，它可以像检测网织红细胞反映骨髓红系的造血情况一样，用来鉴别血小板减少性疾病和监测治疗后的骨髓造血情况。血小板减少症为常见血液病，了解血小板的生成情况对血小板减少症发病机制(生成减少、破坏过多和分布异常等)的判断极为重要。目前临床上主要通过骨髓穿刺涂片，观察MK的数量及成熟情况来作为依据，因受取材、制片及操作者个人主观因素的影响，结果常有一定的偏差;且反复穿刺给病人带来较大痛苦，病人常难以接受，或者通过血小板特异性抗体检测[5]，间接观察血小板破坏情况。传统的RP检测靠显微镜目视计数，费时费力，尤其在血小板减少时更难，从而影响了RP测定的开展和应用，而外周血RP能反映骨髓MK生成血小板的情况。1990年KIENAST等[6]用TO作为RNA的荧光染色，运用流式细胞仪开创了网织血小板的自动化计数，随后有许多作者在此基础上进行改良。本实验以富含血小板血浆代替全血，避免了网织红细胞的荧光干扰，使RP测定的准确性大大提高。同时，应用血小板特异性单抗CD41-PE结合血小板，在流式细胞仪检测中可以准确进行血小板定位，克服较大血小板、残余红细胞及细胞碎片的干扰。不同的作者使用的检测方法中，TO浓度选择20～1 000 μg/L，孵育时间15 min～ 2.5 h 。实验中我们发现在TO溶液中孵育的血小板随TO浓度的增加和孵育时间的增加呈非饱和地增加，这可能与TO的亲脂性有关。血小板有非特异性浓集TO的能力，因此本研究选择自身血小板作为阴性对照，在较低浓度TO(20 μg/L)，较短孵育时间(共50 min)进行，以保证良好的精密度，确保实验结果稳定。目前国际专家小组正在努力使RP的检测方法进一步标准化。在这之前，各个实验室应该建立自己的正常参考值，以达到对临床的辅助诊断目的，本结果RP百分数为(7.38±3.51)%，与国内报道结果相近[7]。本研究结果显示，不同原因引起的血小板减少性疾病，其RP百分数及绝对值不同。ITP病人RP百分数显著高于正常对照组，说明由于外周血小板过度破坏，引起骨髓内MK代偿性增生，致MK数增多，释放至外周血的新生血小板增多，从而RP百分数增高;但由于外周血小板破坏速度超过骨髓MK生成血小板速度，使外周血小板明显减少， 故RP绝对值显著低于正常。在AL、AA病人，其病 因是由于各种原因引起骨髓内MK受抑，产生及释放至外周的血小板显著减少，RP百分数在AA低于正常组，AL变化不明显，而RP绝对值明显低于正常。由此可见，测定外周血RP有助于区分外周 血小板减少是由于血小板生成减少或破坏过多所致。综上所述，通过对传统的RP检测方法的改良，建立一简便、稳定、适用于临床的检测手段，可为临床各类血小板减少性疾病的诊断提供可靠方法。

　　[参考文献]

　　[1] AULTK A， KNOWLES C. In vivo biotinylation demonstrates that reticulated platelets are the youngest platelets in circula- tion[J]. Exp Hematol， 1995，23:996-1001.

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　　[3] 张 之南.血液病诊断及疗效标准[M]. 第2版. 上海:上海科学技术出版社， 1998:20-23.

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　　[5] 李 蔚，侯明，张茂宏，等. PAICA检测ITP病人血小板特异性抗体临床应用 [J].青岛大学医学院学报，2002，38(1):5-6.

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　　[7] 郭 晓 ， 邵平阳， 朱培林， 等. 网织血小板测定对血小板减少疾病诊断价值的探讨 [J].中华内科杂志，2003，42:41-43.