慢病毒载体介导的shRNA对小鼠T细胞CD28基因表达的影响

　　作者：程娜娜1，桑威1，2，陈翀 1，2，徐开林1，2 作者单位：(1.徐州医学院移植免疫实验室，江苏徐州221002;2.徐州医学院附属医院血液科实验室，江苏徐州221002)

　　【摘要】 目的 探讨编码针对小鼠CD28的短发卡状RNA(short hairpin RNA, shRNA)的慢病毒载体对小鼠T细胞CD28基因表达的影响。方法 设计并合成3对靶向小鼠CD28的特异性干扰序列和1对非特异性干扰序列，亚克隆入慢病毒载体pLB中，构建出重组慢病毒干扰质粒，行PCR鉴定并进一步测序证实。分别将重组质粒与慢病毒包装质粒共转染293FT细胞, 生产慢病毒颗粒, 并依据绿色荧光蛋白(GFP)表达水平检测病毒滴度。慢病毒感染小鼠脾淋巴细胞，实时荧光定量RT-PCR和Western blot技术分别从mRNA水平和蛋白水平检测CD28的表达。结果 PCR鉴定及测序结果证实4种重组慢病毒质粒均构建成功，重组慢病毒滴度均达1×1011 U/L。感染T细胞后，CD28基因mRNA和蛋白表达量均有明显下降。结论 成功构建了CD28 shRNA慢病毒载体，可有效下调小鼠T细胞CD28 基因的表达，其为进一步研究体内沉默CD28基因控制移植物抗宿主病奠定了基础。

　　【关键词】 shRNA;慢病毒载体;CD28;移植物抗宿主病

　　The effects of lentiviral vector-mediated delivery of short hairpin

　　RNA on CD28 expression in mouse T lymphocytes

　　CHENG Nana1, SANG Wei1, 2, CHEN Chong1, 2, XU Kailin1,2*

　　(1. Laboratory of Transplant Immunology, Xuzhou Medical College, Xuzhou, Jiangsu 221002, China;

　　2. Laboratory of Department of Hematology, Affiliated Hospital of Xuzhou Medical College,

　　Xuzhou, Jiangsu 221002)

　　Abstract: Objective To explore the effects of lentiviral vector-mediated delivery of short hairpin RNA on CD28 expression in mouse T lymphocytes. Methods Three pairs of specific interference sequences targeting CD28 gene and one pair of non-specific RNA interference sequences were designed and synthesized, and were thereafter respectively inserted into lentiviral vector pLB downstream of U6 promoter, so as to construct four recombinant plasmids. 293FT cells were co-transfected with CD28/shRNA transfer plasmid and two lentiviral packaging plasmids, and the lentivirus titer was determined according to the expression level of green fluorescent protein (GFP). Mouse spleen lymphocytes were infected by three specific or one control lentivirus, and then CD28 mRNA transcription and protein expression of these cells was detected by real-time RT-PCR and Western blot, respectively.Results PCR analysis and DNA sequencing confirmed that the four recombinant lentiviral transfer plasmids were successfully constructed. The titer of recombinant lentivirus was above 1×1011 U/L. After CD28/shRNA virus infection, CD28 expression in mouse T lymphocytes were significantly downregulated at both mRNA and protein levels. Conclusion The lentiviral RNAi vector of CD28 gene have been successfully constructed , and they can effectively inhibit the expression of CD28 gene in mouse T lymphocytes. Thus it provides a basis for further study of CD28 gene-targeted gene therapy on graft-versus-host disease.

　　Key words: short hairpin RNA; lentiviral vector; CD28; graft-versus-host disease

　　异基因造血干细胞移植(allo-HSCT)是目前根治恶性血液病的有效方法，但移植后随之而来的移植物抗宿主病(GVHD)在一定程度上限制了allo-HSCT的临床应用，目前主要靠去除供者T细胞或者用免疫抑制剂来防治GVHD。前者减少了移植物抗白血病(GVL)效应，使白血病复发增多;后者增加了严重感染的机会。因此，寻找控制GVHD的新途径一直是造血干细胞移植领域研究的热点问题。CD28是T细胞表面最重要的共刺激分子，其与抗原呈递细胞(APC)表面的B7分子结合提供T细胞活化所必需的第二信号，这一过程是GVHD发生的关键因素之一。文献报道抑制CD28的表达，阻断共刺激通路，可诱导特异性免疫耐受[1]。

　　RNA干扰(RNA interference，RNAi)是一种序列特异性的、与靶基因同源的双链RNA(dsRNA)所诱导的转录后基因沉默(post-transcriptional gene silencing，PTGS)现象[2]。近年来对RNAi 的研究有了突飞猛进的发展，因其具有特异性强、高效性等优点而在抗肿瘤、抗病毒、基因治疗等领域展示了巨大的潜力。在前期研究中，我们发现短发卡状RNA(short hairpin RNA, shRNA)能够下调CD28 mRNA 的表达水平，同时发现质粒转染可能存在效率低且不稳定的缺点，限制了其在体内的长期研究[3]。慢病毒载体既可感染分裂细胞又可感染非分裂细胞，还可整合入宿主细胞的染色体基因组中，长时间、稳定地引发基因沉默或表达抑制，并且还具有免疫原性低的特点[4]。为了解决抗排斥反应的需要，本研究构建了含小鼠CD28基因的shRNA干扰序列的慢病毒载体，以期获得长期稳定抑制CD28表达的效应，抑制T细胞增殖活化，为在活体内研究其对GVHD的作用奠定基础。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料 雄性C57BL/6小鼠，8～12周龄，无特定病原体(SPF)级，购自徐州医学院实验动物中心。慢病毒包装细胞系293FT细胞，购自美国Invitrogen公司。大肠埃希菌菌株DH5α由本实验室保存。含有U6启动子和绿色荧光蛋白(GFP)的慢病毒转移质粒pLB由美国麻省理工学院Kissler博士惠赠，包装质粒pCMVΔ8.91及包膜蛋白质粒pMD.G为本实验室保存。限制性内切酶HpaⅠ和XhoⅠ、T4 DNA 连接酶购自美国New England Biolabs 公司。胎牛血清(FBS)、DMEM培养基、RPMI 1640培养基、Opti-MEM 培养基购自美国Invitrogen公司。质粒DNA中量提取试剂盒、转染试剂Lipofectamine 2000购自Invitrogen公司。琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒购自Promega公司。抗小鼠CD28单克隆抗体购自Santacruz Biotechnology，碱性磷酸酶标记山羊抗大鼠IgG购自北京中杉金桥公司。Purified anti-mouse CD3ε购自Biolegend公司。聚凝胺购自德国Fluka公司。鼠IL-2购自美国R&D公司。小鼠CD28基因荧光定量PCR试剂盒购自广州达晖生物有限公司。

　　1.2 方法

　　1.2.1 双链DNA的设计及合成 根据Genebank公布的小鼠CD28基因的序列(NM 007642)，设计3对shRNA干扰序列及1对非特异性干扰序列(表1)。经BLAST同源性检索确认与CD28以外的小鼠已知基因序列无同源性。每条Oligo DNA由19 nt的寡核苷酸序列以正反向组合，中间添加Loop结构(TTCAAGAGA)，使寡核苷酸可以形成发夹结构，每对寡核苷酸两端分别带有HpaⅠ和XhoⅠ酶切位点，转录终止信号(TTTTTT)位于Oligo DNA 3′末端。以上Oligo DNA由Invitrogen公司合成。表1 插入慢病毒载体Oligo DNA的序列

　　1.2.2 慢病毒载体的构建及鉴定 设计并合成好的Oligo DNA退火形成双链DNA，与经HpaⅠ和XhoⅠ酶切后胶回收的pLB线性化片段连接，连接后的重组质粒命名为pLB-CD28/shRNA，包括特异性干扰质粒pLB-CD28/shRNA1、2、3和非特异性干扰质粒pLB-CD28/shRNA4。使用载体多克隆位点两端的引物进行PCR扩增并予琼脂糖凝胶电泳鉴定。引物根据Primer Premier5.0软件设计，上游引物: 5′- AAA GGA AAC TCA CCC TAA CTG T -3′ ，下游引物: 5′- TGG AAT CTC GTG AAG CGA G -3′。预期片段大小为171 bp，挑选PCR鉴定与预期相符的重组阳性克隆菌液送Invitrogen公司进一步测序鉴定。

　　1.2.3 慢病毒载体的包装及滴度测定 将包装细胞293FT细胞接种于10 cm培养皿，采用Lipofectamine 2000将pLB-CD28/shRNA、pCMVΔ8.91、pMD.G三质粒进行共转染，转染后24、48 h用荧光显微镜观察转染效率。收集48、72 h病毒上清，4℃ 70 000 g离心2 h，分装后置-80℃保存。采用有限稀释法荧光显微镜下观察GFP表达并计算病毒滴度，公式为：病毒滴度=(GFP阳性细胞个数×稀释倍数)/ml。

　　1.2.4 慢病毒感染脾细胞并分选GFP阳性细胞 取C57BL/6小鼠脾脏单个核细胞，制成细胞密度为1.5×109/L的细胞悬液，在含10% FBS的RPMI 1640培养基(含rhIL-2 1×105U/L、anti-mouse CD3ε 5 mg/L)中培养24 h，以感染复数(MOI)为5的病毒浓缩液感染脾细胞，同时加入终浓度为8 mg/L的聚凝胺及5×104 U/L的rhIL-2，37℃ 1 200 r/min离心90 min。感染6 h后换液，72 h荧光显微镜下观察感染情况。应用荧光激活的细胞分选技术(FACS)分选GFP阳性细胞，置-80℃冰箱保存。

　　1.2.5 实时荧光定量PCR检测小鼠CD28 mRNA表达 用Trizol提取细胞总RNA，经反转录获得cDNA，以GAPDH作为内参照，采用实时荧光定量PCR法检测CD28mRNA的表达情况。CD28基因上、下游引物序列分别为5′-ATA TCT ACT TGG TTT GCT CTT ACT TCC-3′， 5′-AAT AAA ACA AGG CAT GGA GAC AGG-3′;Taqman探针序列为5′-TTT GCC CAA ATG CCA CCT TCA ACT GTA GTT-3′;GAPDH上、下游引物分别为：5′-CGT GTT CCT ACC CCC AAT GT-3′, 5′-TGT CAT CAT ACT TGG CAG GTT TCT-3′; Taqman探针序列为5′-TCG TGG ATC TGA CGT GCC GCC-3′。以上序列由中山大学达晖生物技术有限公司设计并合成，实验操作按试剂盒说明书进行。采用2-ΔΔCt表示 CD28的相对表达量，其中ΔΔCt =〔目的基因的平均Ct值(样本组)-管家基因的平均Ct值(样本组)〕-〔目的基因的平均Ct值(校正组)-管家基因的平均Ct值(校正组)〕。PCR反应采用美国ABI公司7300型荧光定量PCR仪完成。

　　1.2.6 Western blot检测小鼠CD28蛋白表达 常规提取感染72 h后的小鼠T细胞总蛋白，采用改良的Lowrry法测定总蛋白浓度，调整浓度为3.33 mg/L，每次取100 μg总蛋白上样，进行SDS-PAGE电泳，半干转进行蛋白电泳转移，选用NBT/BCIP显色，双蒸水冲洗干燥保存，条带扫描后使用Image J分析软件对蛋白条带的扫描图像进行灰度分析。

　　1.3 统计学处理 采用SPSS 13.0统计软件，行单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 CD28/shRNA重组载体的构建与鉴定 CD28基因shRNA的Oligo DNA，经退火形成双链DNA，与经HpaⅠ和XhoⅠ双酶切后形成的pLB线性载体连接，连接产物转化大肠埃希菌菌株DH5α，挑取重组阳性克隆行PCR鉴定，鉴定结果与预期相符(图1)。测序结果表明合成的CD28 shRNA的Oligo DNA序列正确插入pLB载体中(图2)。

　　图1 重组慢病毒载体阳性克隆的PCR鉴定

　　M.100 bp DNA Ladder;1.空质粒pLB; 2～5.重组质粒pLB-CD28/shRNA1、2、3、4

　　2.2 重组慢病毒载体的包装与滴度测定 将慢病毒包装质粒、包膜质粒分别与构建好的4个慢病毒表达载体混合后共转染293FT细胞，转染后24、48 h荧光显微镜下可见强烈的GFP表达，细胞生长良好(图3);转染后48、72 h收集病毒上清，浓缩后进行病毒滴度测定，pLB-CD28/shRNA1、2、3、4及空载体pLB病毒滴度分别为(1.98±0.23)×1011、(2.21±0.56) ×1011 、(2.09±0.33)×1011、(1.86±0.28)×1011、(2.02 ±0.38) ×1011 U/L。

　　2.3 感染后观察 各组重组慢病毒颗粒感染小鼠脾淋巴细胞，感染后第3天荧光显微镜下观察GFP阳性细胞约占10%。经FACS分选后GFP阳性细胞>95%。

　　2.4 实时荧光定量PCR检测小鼠CD28 mRNA表达 经实时定量PCR检测，特异性干扰质粒pLB-CD28/shRNA1、2、3感染小鼠T细胞后CD28 mRNA表达与正常对照组相比均有下降，差异具有统计学意义(P<0.05);其中CD28/shRNA3基因沉默效应最明显，表达量下降了94.5%，而非特异性干扰组、空载体组与正常对照组相比均无统计学差异(P>0.05)(图4)。

　　2.5 Western blot检测小鼠CD28蛋白表达 结果与实时荧光定量PCR基本一致(图5)。各组慢病毒颗粒感染小鼠T细胞后，CD28/shRNA1、2、3感染组CD28蛋白的表达与正常对照组相比均有下降，差异具有统计学意义(P<0.05);其中CD28/shRNA3基因沉默效果最明显，蛋白表达量下降了70.0%，而非特异性干扰组、空载体组与正常对照组相比均无统计学差异(P>0.05)。

　　3 讨 论

　　在移植排斥反应及移植物抗宿主病的发生过程中，T细胞作为主要的效应细胞，在此过程中起着重要的作用[5]。CD28作为T细胞表面的抗原分子，与配体结合后产生的CD28/B7共刺激信号是T细胞活化和增殖所必需的。如果阻断这一环节，T细胞增殖及排斥反应的发生将得到有效遏制，从而诱导抗原特异性的免疫耐受。文献报道应用CD28单克隆抗体可以减轻小鼠GVHD的发生[6]。

　　RNAi现象由Fire等[7]发现于秀丽杆线虫，是一种转录后基因沉默现象，后来发现此现象也存在于哺乳动物，因其具有快速、有效、容易操作、序列特异性强等优点，已被广泛应用于基因功能分析、信号转导通路和基因治疗的研究[8-10]。最初的RNAi实验采用体外合成小干扰RNA(small interference RNA, siRNA)的方法，但存在费用昂贵、容易降解、干扰时间短等缺点。目前常用的是含有RNA聚合酶Ⅲ(如U6或H1)或聚合酶Ⅱ启动子的载体，U6和H1启动子可在哺乳细胞内有效表达，与其连接的核酸可被加工成与相应双链RNA (dsRNA) 同源的shRNA，shRNA在Dicer酶作用下被加工成具有沉默效应的siRNA。为了提高转染效率，研究者设计了含有U6或H1启动子的病毒载体，包括腺病毒、逆转录病毒和慢病毒载体。慢病毒载体因其具有可感染分裂期与非分裂期细胞[11]、感染效率高、转移基因片段容量较大等优势而被广泛应用。尤其是其遗传物质能够整合到宿主的基因组, 可进行长时间的稳定表达, 适用于体内RNAi 的研究, 是携带干扰RNA 的理想载体[12-13]，同时也扩大了载体感染细胞的范围[14]。

　　本研究采用三质粒包装系统，由pLB、pCMVΔ8.91和pMD.G组成。其中pLB为慢病毒转移质粒，含有U6启动子，能在宿主细胞中持续转录成shRNA，再生成有干扰作用的siRNA，同时该质粒能表达有CMV启动子驱动的GFP，用于检测病毒包装的转染效率及感染目的细胞的感染效率。 pCMVΔ8.91质粒中含有HIV 病毒的gag、pol和rev基因。其中，gag编码病毒主要的结构蛋白，pol编码病毒特异性的酶，rev 编码的蛋白调节gag 和pol 的表达水平。pMD.G 质粒中含有水疱状口炎病毒的G糖蛋白(VSV-G)基因，使病毒颗粒能够结合于靶细胞上。293FT细胞作为病毒包装细胞，在包装后能够产生高滴度的病毒颗粒，同时表达报告基因。

　　本研究设计了3个CD28基因的干扰靶点，成功构建了含有GFP报告基因的CD28 shRNA慢病毒表达载体，能有效抑制T细胞表面CD28的表达，其为进一步研究体内沉默CD28基因控制GVHD的作用奠定了基础。

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