儿童急性淋巴细胞白血病TEL基因微卫星不稳定性 检测的临床意义

　　作者：管洪在，王海燕，乔宏，吴春梅 　(青岛大学医学院血液学教研室，山东 青岛 266021; 青岛大学医学院附属医院输血科)

　　[摘要]目的 检测12号染色体TEL基因微卫星不稳定性(MSI)和杂合性缺失(LOH)情况，以探讨其与儿童急性淋巴细胞白血病(ALL)发生、发展及预后的关系。方法 选取53例初诊儿童ALL作为病例组，15例良性血液病作为病例对照，5例正常儿童作为正常对照。采用多重PCR、聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染技术检测了12号染色体上TEL基因附近的4个微卫星位点(D12s89、D12s98、D12s269、D12s358)的MSI和LOH发生情况，并对其中18例病儿进行了初诊、缓解和复发期MSI和LOH情况的检测。结果 53例初诊ALL病儿MSI和LOH总的发生率分别为3.77%和43.40%，其中D12s89位点LOH的发生率最高，为39.62%，D12s269位点LOH的发生率最低，为9.43%( χ2 =5.24，P <0.01);动态检测其中的18例病儿发现，初诊期LOH的发生率为61.11%，缓解期为11.11%，复发期为66.67%，初诊和复发期各位点LOH的发生率明显高于缓解期( χ2 =8.88、11.69，P <0.01);3例初诊未检测出LOH的病儿，复发期3位点同时检测到LOH;2例病儿在初诊、缓解和复发期均检测到LOH。5例正常对照和15例良性血液病对照均未检测到LOH及MSI的发生。结论 TEL基因与儿童ALL的发生、发展有关，微卫星不稳定性的检测可用于白血病的诊断、鉴别诊断及预后判断，并可作为临床上微小残留白血病的检测方法之一。

　　[关键词] 白血病，淋巴细胞;TEL基因;杂合性缺失;聚合酶链反应

　　CLINICAL SIGNIFICANCE OF MEASUREMENT OF MICROSATELLITE INSTABILITY OF TEL GENE IN CHILDHOOD ACUTE LYMPHOBLASTIC LEUKEMIA

　　GUAN HONG-ZAI， WANG HAI-YAN， QIAO HONG， et al

　　(Department of Hematology， Qingdao University Medical College， Qingdao 266021， China)

　　[ABSTRACT]ObjectiveTo investigate the correlation between TEL gene and the occurrence， progression and prognosis a-cute lymphoblastic leukemia (ALL) in children. MethodsMSI and LOH in 53 children with ALL，15 with benign hematopathies and five normal children were detected by multiplex-PCR amplification at four microsatellites linked to TEL gene on chromosome 12， gel electrophoresis and argentine dye. ResultsLOH in 23 cases (23/53)， the frequency of LOH on four microsatellites (D12s89， D12s98， D12s269， D12s358) was 43.40%， among those microsatellites， the expression ratio of LOH on D12s89 was the highest (39.62%). Two cases were detected MSI on D12s89， D12s98， D12s269， its frequency was 3.77%. At the same time， LOH and MSI were dynamic observed in the three stages (preliminary， remission， relapse)in 18 cases of all the patients， the fre-quency of LOH in the three stages was 61.11%， 11.11% and 66.67%， respectively ( χ2 =8.88， 11.69; P <0.01). LOH and MSI were not found in preliminary stage， but LOH was found simultaneously in three loci in the relapse stage. LOH was consistently detected in the three stages in two cases. LOH and MSI were not found on the four sites in 15 cases of benign hematopathies and five healthy children. ConclusionTEL gene is related to the occurrence and development of childhood ALL. The detection of MSI can be used in the diagnosis， differential diagnosis， and prediction of the prognosis of the disease， which can also be used to de-tect minimal residual leukemia.

　　[KEY WORDS]leukemia， lymphocytic; TEL gene; loss of heterozygosity; polymerase chain reaction

　　微卫星是广泛存在于原核及真核细胞基因组中的简单串联重复的DNA序列，约占人类基因组的10%[1]，它具有丰富的多态性、高度的杂合性以及较低的重组率等特点。近年来，人们利用微卫星多态性检测可发现传统核型分析很难检测到的染色体细 微差别，在某一染色体的某一片段上选择一系列相邻的微卫星进行分析，可推测这一区域是否存在抑癌基因以及某肿瘤易感基因与该肿瘤的相关意义。TEL基因是在急慢性白血病、骨髓增生异常综合征(MDS)和某些恶性淋巴瘤中均受累的所谓“杂合”基因，它的特点在于多种染色体易位都可导致TEL重排，而不同的TEL基因重排可通过不同的机制参 与白血病的发生[2]。 TEL 基因的重排或突变常表 3期管洪在，王海燕，乔宏，等.儿童急性淋巴细胞白血病TEL基因微卫星不稳定性检测的临床意义195现为微卫星不稳定性(MSI)和杂合性缺失(LOH)，其在儿童白血病发病机制中的作用已引起人们的重视。本研究选取12p13 TEL基因附近4个微卫星位点进行MSI和LOH的研究，以进一步探讨TEL基因微卫星的改变与儿童急性淋巴细胞白血病(ALL)的发生、发展的关系。

　　1 资料和方法

　　1.1 研究对象 病例组为2003年10月～2005年8月间青岛大学医学院3所附属医院儿内血液科53例初发儿童ALL，男30例，女23例;年龄3～13岁，平均6岁;53例中45例为B-ALL，8例为混合型T-B ALL。病例对照组为15例良性血液病病儿，男10例，女5例;年龄5～12岁，平均8岁;其中缺铁性贫血(IDA)10例，巨幼细胞贫血(MA)2例，原发性血小板减少性紫癜(ITP)3例。以上所有病例均符合《血液病诊断和治疗标准》[3]。随机收集5例健康儿童作为正常对照。每例病儿提取骨髓细胞DNA进行检测，同时检测口腔黏膜细胞DNA作自身正常对照，并对儿童ALL中18例进行了初诊、缓解和复发期的动态检测。

　　1.2 实验方法

　　1.2.1标本采集 病例组采集白血病病儿新鲜骨髓涂片2～3张，或新鲜抗凝骨髓液0.5 mL，置 -20 ℃ 保存备用;同时用消毒竹签刮取病儿口腔黏膜，作为自身对照，放入盛有0.5 mL无菌生理盐水的EP管中，-20 ℃保存备用。病例对照组标本收集同病例组;正常对照组采集外周静脉血和口腔黏膜。

　　1.2.2标本DNA的提取 骨髓和外周血标本DNA提取采用常规酚抽提法。将收集的口腔黏膜标本低温5 000 r/min离心10 min，弃上清，将沉淀物用生理盐水洗涤2次，低温5 000 r/min离心 10 min ，弃上清液，加入TE消化液(含100 mg/L的蛋白酶K和1 g/L的Tween 20)100 μL，52 ℃水浴3 h以上，100 ℃煮沸10 min，低温5 000 r/min离心20 min，取上清，用紫外线分光光度计检测提取的DNA的浓度，-20 ℃保存备用。

　　1.2.3位点选择及引物合成 选择TEL基因附近连锁的4个微卫星位点D12s89、D12s98、D12s358、D12s269，从Genome Data Base(http://www.gdb.org)查出其引物序列，由上海生工公司合成。

　　1.2.4多重PCR扩增 以同一基因连锁的2个微卫星序列引物(D12s89和D12s98，D12s269和D12s358)进行多重PCR扩增，25 μL反应体系中含有模板DNA 0.25 ng，4×dNTP各125 μmol/L，引物各10 pmol，Taq plusⅠ DNA聚合酶1 U，10×buffer 4 μL(内含Mg2+)。PCR基本反应程序为:95 ℃ 预变性5 min，95 ℃ 30 s，53 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s ，35个循环之后72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。将PCR扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染，最后用YLN2K分子生物学影像分析仪对银染结果进行分析。

　　1.2.5观察分析 正常组织来源的标本扩增产物经电泳银染后应出现两条等位基因条带;如果病儿组织标本和自身对照扩增产物经电泳银染后均只有一条等位基因条带，则为非信息个体，无法判断其是否发生了MSI和(或)LOH。与病儿自身正常组织比较，若某一微卫星位点的等位基因条带增多或位置发生改变，则为MSI。与病儿自身正常组织比较，若某一微卫星位点的等位基因条带消失或相对密度减少50%以上则为LOH[4]。数据处理采用卡方检验。

　　2 结果

　　2.1 正常对照和病例对照组LOH和MSI的发生情况 5例正常对照组标本和15例病例对照组标本均无LOH和MSI发生。

　　2.2 病例组LOH和MSI的发生情况 53例初诊儿童ALL有23例在TEL基因附近发生LOH(图1)，并呈多位点同时出现LOH现象。其LOH的总检出率为43.40%，而D12s89、D12s98、D12s358、D12s269各位点的发生率呈下降趋势，分别为39.62%、35.85%、18.87%和9.43%( χ2 = 16.769 ，P <0.01)，4位点中D12s89位点的LOH表达率最高。53例标本中共有2例发生MSI，D12s89、D12s98、D12s358和D12s269各位点发生率分别为1.89%、1.89%、1.89%和0。

　　2.318例儿童ALL三期各微卫星位点LOH和MSI的发生情况 儿童ALL初诊、缓解和复发期的MSI发生率无明显差异( P >0.05);初诊和复发期LOH的发生率明显高于缓解期( χ2 =8.88、11.69，P <0.01)，其中D12s89位点LOH的发生率最高， 初诊期与缓解期、复发期与缓解期比较，差异均有显著意义( q= 3.587 、4.887，P <0.05)。见表1。

　　图1 部分病儿杂合性缺失的凝胶电泳结果 (略)

　　M为相对分子质量标准，④、⑦、⑧泳道箭头所示为部分标本在D12s98位点检测到杂合性缺失

　　表1 18例儿童ALL三期各微卫星位点LOH和MSI的发生率(略)

　　3 讨论

　　恶性肿瘤的发生发展与癌基因的激活和抑癌基因的失活有关[5]。迄今发现80%～90%的白血病病儿有某种克隆性染色体异常，表现为染色体的易位和丢失，进而导致原癌基因的激活或抑癌基因的失活，或产生新的融合基因，表达与增殖有关的调节蛋白，从而引起细胞的恶性转化。传统的细胞遗传学方法仅能发现较大片段的染色体的改变，而对于较小片段的染色体改变，常规的核型分析往往难以发现。微卫星是广泛分布于基因组中简单串联重复的DNA序列，通常以1～6个核苷酸为重复单位，这种短串联重复序列长度一般小于60 bp。在某些因素的作用下，细胞或机体内部调节修复系统功能缺陷时，微卫星可出现MSI和LOH。MSI指重复序列重复次数的增加或减少，LOH是指信息个体某一微卫星位点两个等位基因的其中之一发生丢失，也有人认为LOH是MSI的一种特殊现象。检测微卫星不稳定性变化可以分析较小片段的、亚显微结构的染色体改变，比细胞遗传学精确度高，因此可以寻找和定位可能的肿瘤抑癌基因。 位于12p13的TEL基因是许多染色体异常累及的靶基因，到目前报道的TEL基因相关的染色体易位超过30种。不同的TEL基因重排可通过不同的机制参与白血病的发生[6]，当TEL基因发生突变/缺失或易位，都可导致DNA功能缺陷，使广泛的基因组稳定性下降，继而使癌基因和抑癌基因的突变率增加，肿瘤易感并进展，主要表现为等位基因的不平衡性，包括微卫星不稳定性和杂合性缺失。t(12;21)是儿童ALL中最常见的结构染色体异常，易位形成的TEL/AML1融合基因约占B系儿童ALL的40%，并与预后相关[7]。因此本研究选取儿童ALL TEL基因附近的4个微卫星位点D12s89、D12s98、D12s358和D12s269来进行研究，以揭示微卫星不稳定性与ALL发生、发展的关系。53例初诊病儿在所选的4位点有较高的LOH发生率，离TEL基因越近的位点(D12s89、D12s98)微卫星不稳定性的发生率远高于离TEL基因稍远的位点(D12s269、D12s358)，其中D12s89位点LOH的表达率最高，并呈多位点同时表达现象。这种TEL基因连锁微卫星LOH的表达，表明TEL基因附近可能存在候选抑癌基因，候选抑癌基因的缺失在儿童ALL的发病中起到了至关重要的作用。我们还观察到初诊时检测到LOH的病儿较未检测到LOH的病儿对常用的化疗药物敏感，易于缓解，而且缓解时间较长，预后较好，这与JEFFREY等[8]的报道相吻合。由此可见，TEL微卫星不稳定性的改变可用于儿童ALL的预后判断。本研究中正常对照组和良性血液病组所有位点均未检测到LOH和MSI，表明正常人和良性血液病病儿不出现微卫星遗传标记的改变，只有恶性血液病细胞才发生LOH或MSI，多个位点微卫星标记技术可快速、有意义地检出染色体基因组的不稳定性和微小缺失，且多重PCR技术有灵敏度高、特异性强、产率高、重复性好等优点。因此，多重PCR技术检测微卫星LOH或MSI可以用来帮助鉴别良、恶性血液病。动态检测18例儿童ALL发现，初诊和复发期LOH的发生率较高，缓解期发生率明显降低，而MSI在三期的改变不明显。在缓解期仍检测到LOH的病例，经动态观察，均在短时间内复发，预后不良，表明TEL基因微卫星LOH的改变与病程的进展相关。多数病儿表现为初诊和复发时微卫星LOH的位点完全相同，这可能是同一恶性克隆的复发。研究中还发现，3例病儿初诊时4位点均未检测到LOH和MSI，而复发期在D12s89、D12s98与D12s269三位点同时检测到LOH的发生，该现象说明在疾病的进展中出现了新的异常克隆，这与TAKECHI等[6]的报道一致。缓解期检测到LOH的现象，是由于体内微量残留白血病(MRL)所致，从分子生物学上说明了微小残留白血病的存在。MRL是指急性白血病诱导化疗或骨髓移植，达到临床和血液学的完全缓解，而体内残存微量白血病细胞的状态，这些微量残留白血病细胞的增殖和扩散是白血病复发的根源。因此，多重PCR检测微卫星不稳定性以其灵敏度高、特异性强等优点可作为临床上微小残留白血病的检测方法之一。

　　[参考文献]

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　　[7] SHURTLE S A， BUIJS A， BEHM F G， et al . TEL/ AML1 fusion resulting from a cryptic t(12;21) is the most common genetic lesion in pediatric ALL and defines a subgroup of pa-tients with an excellent prognosis[J] . Leukemia， 1995，9:1985-1989.

　　[8] JEFFREY E， RUBNIZ J E， JAMES R， et al. Tel gene rear-rangement in ALL: a new genetic marker with prognostic sig-nificance[J]. J Clin Oncol， 1997，15:1150-1156.