端粒酶活性检测对急性髓细胞白血病的临床意义

　　作者：乔宏，郭小芳，卢伟 　(青岛大学医学院血液学教研室，山东 青岛 266021)

　　[摘要]目的 研究急性髓细胞白血病(AML)的端粒酶活性表达情况，探讨端粒酶活性检测对AML的临床意义。方法 选取不同亚型AML病人74例，以良性血液病和骨髓形态学正常的非血液病病人作对照，采用改良TRAP-银染法及亚利恩凝胶成像系统分析检测其骨髓标本内的端粒酶活性水平并随访。结果 良性血液病病人端粒酶阴性或低水平表达;AML初诊时端粒酶活性显著升高( F=36.76，q=14.65，P <0.01)，完全缓解后活性下降( q=10.75，P <0.01)，复发时端粒酶活性又升高( q=7.61，P <0.01)。同时端粒酶活性与预后相关，活性高者往往预后较差。结论 端粒酶活性与AML的发生、发展密切相关，可作为AML恶性克隆增殖的分子标志。

　　[关键词] 端粒酶;白血病;聚合酶链反应

　　CLINICAL SIGNIFICANCE OF TELOMERASE ACTIVITY IN PATIENTS WITH ACUTE MYELOCYTIC LEUKEMIA

　　QIAO HONG， GUO XIAO-FANG， LU WEI

　　(Department of Hematology， Qingdao University Medical College， Qingdao 266021， China)

　　[ABSTRACT]ObjectiveTo study the expression of telomerase activity in patients with acute myelocytic leukemia (AML) and its clinical significance. MethodsAML patients ( n =74)， benign hematologic patients， and non-hematologic patients with normal bone marrow as controls， were included in this study. Modified TRAP-silver staining and Yalien analyzing software were used to analyze the corresponding data. ResultsExpression of telomerase of the controls was negative or low. For the AML pa-tients， the telomerase activity increased significantly at the initial stage ( F=36.76，q=14.65，P <0.01)， then decreased after com-plete remission ( q=10.75， P <0.01) and increased again at relapse ( q=7.61，P <0.01). High level of telomerase activity was as-sociated with poor prognosis. ConclusionActivation of telomerase is closely related with the occurrence and development of acute myelocytic leukemia， which could be used as a molecular marker for evaluation of malignant clonal proliferation.

　　[KEY WORDS]telomerase; leukemia; polymerase chain reaction

　　为了解端粒酶在急性髓细胞白血病(AML)中的表达情况及其临床意义，本文采用改良TRAP-银染法检测了74例AML病人骨髓单个核细胞端粒酶活性，同时对部分病例进行了动态观察，探讨端粒酶活性与AML的关系。

　　1 资料和方法

　　1.1 一般资料 AML病人74例，分为初诊组(37例，其中M1 亚型5例，M2 亚型10例，M3 亚型9例，M4 亚型6例，M5 亚型7例)、治疗组(15例)、完全缓解组(14例)和复发组(8例)。将未经过任何处理的初诊病人列为初诊组，将已行化疗但尚未达到完全缓解的病人列为治疗组，将化疗后处于完全缓解持续期的病人列为完全缓解组，将复发病人列为复发组。另取20例良性血液病及16例非血液病病人作为对 照，其中缺铁性贫血(IDA)10例，巨幼细胞贫血(MA)6例，特发性血小板减少性紫癜(ITP)4例。所有病人诊断均符合文献[1]诊断标准，非血液病病人均经骨髓细胞形态学检查排除血液病。

　　1.2 方法

　　1.2.1端粒酶提取 参考文献[2]方法，常规提取端粒酶，置-20 ℃保存。

　　1.2.2TRAP反应 参考文献[2]的方法并略加改进，50 μL反应体系含:20 mmol/L tris-HCl， 1.0 mmol/L MgCl 2 ，63 mmol/L KCl， 0.05 g/L Tween 20，1 mmol/L EGTA，50 μmol/L dNTPs， 0.1 μg的TS引物，体积分数0.001牛血清清蛋白， 2 μL 端粒酶提取液，0.1 μg的CX引物，2 U的Taq DNA聚合酶。30 ℃孵育30 min后，94 ℃变性 30 s， 55 ℃退火 30 s ，72 ℃延伸30 s，30个循环后 72 ℃ 保温3 min。

　　1.2.3电泳及银染 PCR扩增产物经120 g/L聚丙烯酰胺凝胶电泳后，置于AgNO3 溶液中染色 10 min， 蒸馏水洗涤后显色。

　　1.2.4端粒酶活性测定 用亚利恩凝胶成像分析系统处理，得出各标本的相对吸光度( A )值代表端粒酶活性。根据吸光度值大小将端粒酶活性分为阴性“-”(吸光度值<0.5)，弱阳性“±”(吸光度值 0.5～ 2.0 )，阳性“+”(吸光度值2.1～7.0)，强阳性“ ”(吸光度值>7.0) 4个等级，并以阳性及强阳性标本比例表示阳性率。

　　1.2.5统计学处理 结果以 x±s 表示，数据间比较采用方差分析。

　　2 结果

　　非血液病组端粒酶均呈阴性或较低水平表达，无1例阳性或强阳性表达。20例良性血液病病人平均端粒酶活性为0.72±0.58，均无端粒酶阳性或强阳性表达者。16例非血液病对照组端粒酶活性为0.79±0.62。良性血液病与非血液病组比较差异无显著性( F=60.73，q=0.04～0.33，P >0.05)。良性血液病不同病种间的差异亦无显著意义( q= 0.08～ 0.41，P >0.05)。AML病人初诊组、治疗组、完全缓解组、复发组端粒酶活性分别为4.65±1.36、4.01±1.89、1.68±0.46、4.95±0.86，阳性率分别为78.4%、73.3%、35.7%、67.0%。与非血液病组比较，AML病人初诊组和治疗组端粒酶活性显著升高( F= 36.76 ，q=14.65、10.17，P <0.01)，完全缓解后端粒酶活性水平下调( q=10.75、7.12，P <0.01)，而复发时端粒酶活性又升高( q=7.61， P < 0.01)。完全缓解组与初诊组、治疗组、复发组及非血液病组端粒酶活性间差异均有显著性( q= 2.76～ 14.65，P < 0.05 )。而初诊组、治疗组和复发 组三者的端粒酶活性差异无显著性( q=0.77～2.37， P > 0.05)。AML各亚型间端粒酶活性M 1 为4.05± 0.86，M2 为3.95±0.95，M3 为4.98±0.83，M4 为4.55±0.75，M5 为4.87±0.88，AML各亚型端粒酶活性均升高( F=50.32，q= 11.30～ 17.85， P < 0.01 )，但各亚型间的端粒酶活性差异无显著意义( q= 0.32～3.98，P >0.05)。随访发现，完全缓解期端粒酶活性仍高于正常的5例病人中3例缓解持续期极短，3个月内即复发。对复发组病人的随访结果发现，2例端粒酶弱阳性者均取得了再次缓解，而1例端粒酶强阳性者未能取得再次缓解。

　　3 讨论

　　AML是一种临床死亡率较高的血液系统恶性 肿瘤。本文对74例AML病人研究发现，大部分AML端粒酶活性显著升高，78.4%的病人端粒酶呈阳性，而IDA、MA、ITP等良性血液病及正常人端粒酶均阴性或低水平表达，无1例表达阳性或强阳性。这表明端粒酶活性与恶性克隆增殖密切相关。同时本文研究证实，AML初诊时端粒酶活性升高，完全缓解后水平下调，复发时又升高，这说明端粒酶活性程度与AML的分期和病情进展存在着极为密切的相关性，可能是AML进展过程中白血病细胞增殖的一个分子标志。AML各亚型间端粒酶活性无明显差异，提示端粒酶活性与AML的FAB分型无相关性，端粒酶活性检测不能用于AML亚型的鉴别诊断。本文研究显示，约有30%的初诊AML病人端粒酶活性不增高，呈阴性或低水平表达，临床追踪发现这部分病人化疗效果较好，可能意味着端粒酶阴性的病人体内白血病细胞具有较好的诱导分化能力，对治疗敏感。AKIYAMA等[3]的研究显示，用全反式维甲酸治疗急性早幼粒细胞白血病可导致端粒酶活性迅速降低。本文中14例经化疗后达完全缓解的AML病例中约65%的病人端粒酶为阴性或呈低活性，说明经诱导分化后白血病细胞的端粒酶活性减低。成年T细胞白血病病人端粒酶活性高者预后差[4]，本文对AML的随访发现，完全缓解期端粒酶活性仍高于正常水平的5例病人中3例缓解持续期极短，短期内复发，提示端粒酶活性与AML病人的预后相关，可能成为AML的一个新的预后指标。随着白血病治疗的进展，尤其是大剂量化疗和骨髓移植的广泛开展，白血病完全缓解后AML的诊断及治疗已成为当今研究的重点之一。本文研究表明，AML完全缓解后端粒酶活性仍中度升高，说明AML经化疗后，药物虽然杀死了绝大部分白血病细胞，取得了临床和血液学完全缓解，但仍残存着常规方法无法检测到的少量白血病细胞即微量残留白血病。微量残留白血病是白血病复发的根源。因此，端粒酶活性检测有希望成为一种监测微量残留白血病的新的分子生物学标记。TATEMATSU等[5]还发现，AML复发病例端粒酶活性与初发时相比似乎有升高的趋势，认为端粒酶活性升高对于疾病进一步恶化可能必不可少。本文对AML复发病例的随访结果表明，复发时端粒酶活性水平低者更易获得再次缓解，其预后更好。故端粒酶活性的检测对AML的预后及微量残留白血病的监测都有重要意义。抑制端粒酶活性可抑制白血病细胞的生长[6]。同时，正常情况下绝大多数人体组织细胞端粒酶表达阴性，所以用抗端粒酶治疗的副作用较小。本文研究结果为这一疗法的临床应用提供了可靠的理论基础。

　　[参考文献]

　　[1] 张 之南，沈悌.血液病诊断及疗效标准[M]. 第2版. 北京:北京科学出版社， 1998:258-267.

　　[2] KIM N W， PIATYSZEK M A， PROWSE K R， et al. Specific association of human telomerase activity with immortal cellsand cancer [J] . Science， 1994，266(23):2011.

　　[3] AKIYAMA M， YAMADA O， YANAGISAWA T， et al. A-nalysis of telomerase activity and RNA expression in a patient with acute promyelocytic leukemia treated with all-trans retin-oic acid [J]. Pediatr Blood Cancer， 2005，15(3):1.

　　[4] KUBUKI Y， SUZUKI M， SASAKI H， et al. Telomerase ac-tivity and telomere length as prognostic factors of adult T-cell leukemia [J]. Leuk Lymphoma， 2005，46(3):393.

　　[5] TATEMATSU K， NAKAYAMA J， DANBARA M， et al. A novel quantitative stretch PCR assay， that detects a dramatic increase in telomerase activity during the progression of mye-loid leukemias[J]. Oncogene， 1996，13(10):2265.

　　[6] ROTH A， VERCAUTEREN S， SUTHERLAND HJ， et al. Telomerase is limiting the growth of acute myeloid leukemia cells[J]. Leukemia， 2003，17(12):2410.