大鼠视网膜微血管内皮细胞的分离培养及血管形成体系的建立
发表时间：2010-06-04 浏览次数：403次
作者：崔丹，王哲，杨向红 作者单位：(中国医科大学附属盛京医院病理科， 辽宁 沈阳 110004)
【摘要】 目的 应用Matrigel建立大鼠视网膜微血管内皮细胞(Retinal Microvascular Endothelial Cells, RMECs)血管形成的体外培养体系，为进一步探讨视网膜相关疾病提供实验基础。方法 体外培养RMECs，在Matrigel上建立血管形成的体外培养体系。结果 经分离培养的RMECs在 Matrigel上培养形成管腔样结构。结论 RMECs能够在Matrigel上形成血管腔。
【关键词】 视网膜微血管内皮细胞;细胞培养;血管形成
Isolation and Culture of Rat Retinal Microvascular Endothelial Cells andInducing Cells to Form New Blood VesselsCUI Dan, WANG Zhe, YANG Xianghong
( Department of Pathology, Shengjing Hospital Affiliated China Medical University, Shenyang 110004 China)Abstract: Objective To induce Rat Retinal Microvascular Endothelial Cells (RMECs) to Form New Blood Vessels by setting up a stable angiogenesis culture system on Matrigel. It would be a basic experimental study for the retinal-related disease. Methods By culturing RMECs in vitro and setting up a stable angiogenesis culture system on Matrigel. Results RMECs were lumina formation on Matrigel. Conclusions RMECs can be induced to form mew blood vessels on Matrigel in vitro.
Key words: Retinal Microvascular，Endothelial Cells; cell culture; angiogenesis
血管内皮细胞密切参与糖尿病微血管病变和肿瘤血管新生等病理过程[1,2]。视网膜微血管内皮细胞(Retinal Microvascular Endothelial cells，RMECs)能合成和分泌多种物质，是糖尿病微血管病中各种生理、病理因素作用的靶细胞[3]。本实验在体外培养RMECs，应用Matrigel建立血管形成的体外培养体系，为进一步探讨视网膜相关疾病提供实验基础。
1 材料与试剂
1.1 实验动物 SD大鼠，体重100～150 g，中国医科大学实验动物部。
1.2 试剂 DMEM培养基(Sigma)、胎牛血清(天津灏洋)、Ⅱ型胶原酶(Gibco)、胰酶(Biosharp)、内皮细胞生长添加物(ECGS、实验室自制)、肝素钠(上海精析)、Percol液(天津灏洋)、明胶(Sigma)、Matrigel(Becton Dickison) 、兔Ⅷ因子相关抗原多克隆抗体(santa cruz)。
2 实验方法
2.1 原代细胞分离培养 参照文献[4,5]并加以改善进行细胞分离培养。①分离视网膜微血管段：SD大鼠过量乙醚处死，完整摘除眼球，70%乙醇浸泡30 s，沿角膜缘剪开，去除晶状体和角膜，分离出视网膜组织，除去可见的主枝大血管，于PBS中简单漂洗、剪碎。将剪碎的视网膜组织首先经过80目尼龙筛网滤过，收集网下液;再经过200目筛网，收集网上液后2 500 r/min离心12 min，弃上清，得到视网膜微血管段。②视网膜微血管段的消化和培养：加入5～10倍体积的0.1%Ⅱ型胶原酶消化,37 ℃振荡水浴30～50 min，吹打10 min;离心，沉淀物用DMEM清洗2 次，将视网膜微血管段置于事先用0.5%明胶铺过的培养瓶内,加入适量的DMEM培养基(含20%胎牛血清、ECGS 400 μg/mL、肝素钠200 μg/mL、青霉素100 U/mL、链霉素100 μg/mL)，37 ℃、5% CO2孵育箱培养。每日倒置相差显微镜下进行形态学观察。
2.2 传代细胞培养 48 h后第1次换液清除未贴壁的细胞，以后隔日换液。原代细胞长至亚融合即可传代，以0.125%胰酶(含0.01%EDTA)消化细胞，倒置相差显微镜下观察，细胞收缩变圆，即终止消化，吹打制成细胞悬液，按1:2～3接种。
2.3 RMECs的鉴定
崔丹，等：大鼠视网膜微血管内皮细胞的分离培养及血管形成体系的建立辽宁医学院学报 2009年10月，30(5)2.3.1 形态学观察 用倒置相差显微镜直接观察细胞的生长过程及形态特点，并拍照记录。
2.3.2 免疫荧光法检测第Ⅷ因子相关抗原 将培养的细胞接种于铺有盖玻片的24孔板中，细胞用4%多聚甲醛固定10 min，PBS洗后，滴加0.1% Triton-100“打孔”，室温10 min;PBS洗;5%BSA封闭10 min，弃去不洗，滴一抗(1：300)，4℃孵育过夜;PBS洗，滴加荧光标记羊抗兔二抗(1：100)，室温1 h，PBS洗，90%甘油封片。荧光显微镜观察。
2.4 Matrigel上诱导血管形成 Matrigel冻存于-20 ℃，使用前置于4 ℃过夜，使其融化成胶状液体备用。将Matrigel以100 μL/孔滴在24孔培养板内，轻轻摇晃培养板，使其铺平。把培养板置入37 ℃、5%CO2孵育箱内，待Matrigel聚合，30 min后即可使用。细胞消化成单细胞悬液后接种于Matrigel上，观察管腔形成情况。
3 结 果
3.1 细胞形态和生长特征观察 视网膜组织经筛网过滤及胶原酶消化后，得到高纯度的微血管段。原代培养时1 d即开始贴壁，2 d时贴壁显著增多。倒置相差显微镜下观察，贴壁后可见RMECs自微血管段中游出，早期细胞呈短梭形，逐渐长成单层，呈“铺路石样”排列生长(图1)。5～7 d细胞长至融合，融合的细胞大小均匀，传代细胞生长速度明显加快。
3.2 免疫荧光法检测第Ⅷ因子相关抗原 经第Ⅷ因子间接免疫荧光鉴定，RMECs胞质和胞膜处呈绿色荧光(图2)，即表达较高密度的Ⅷ因子相关抗原，证实其为RMECs。
3.3 Matrigel上细胞生长状态观察 在Matrigel上培养的细胞形成明显的网络状管腔样结构(图3)。
4 讨 论
内皮细胞的分离方法一般采用胶原酶消化法，胶原酶的浓度和消化时间很重要。经过反复实验摸索，使用0.1%浓度胶原酶、作用时间30～50 min，实验效果较好。胶原酶孵育导致组织松散，吹打过程有助于内皮细胞与其它细胞分离，是很重要的一步。
将视网膜置于70%乙醇灭活30 s，可减少污染。
RMECs培养的关键是内皮细胞的纯度。在培养液中加入ECGS和肝素可以使细胞向内皮细胞方向生长;在培养过程中，我们发现，内皮细胞与其它细胞相比，先收缩变圆并脱落下来，并且比其它细胞容易贴壁。根据这一点，采用快速传代、传代后早换液的方法，可以在一定程度上纯化RMECs。
Matrigel是一种从(Engelbreth-Holm-Swarm，EHS)小鼠肉瘤中提取的可溶性基底膜样物质，这种肉瘤富含ECM蛋白。Matrigel为细胞的迁移、侵袭、管腔结构的形成及细胞的生化功能、基因表达的研究提供了相关的环境。细胞在Matrigel上培养形成明显的网络状管腔样结构，是内皮细胞的特点之一。
体外培养内皮细胞是研究内皮细胞与多种疾病的病理生理过程相关的重要方法。本研究提供了一种体外培养RMECs的方法并利用Matrigel建立其体外血管形成体系，为进一步探讨视网膜相关疾病提供了实验基础。
【参考文献】
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