乙肝患者血浆MBL水平分析

　　作者：赵铁军 杨翠军 侯丽娟 贾天军 张林西 作者单位：河北北方学院实验中心,河北 张家口 075000

　　【摘要】 目的:检测健康人及乙肝患者血浆中甘露聚糖结合凝集素(MBL)水平，比较差异并评价其非特异性免疫功能。方法：采用MBL ELISA试剂盒检测健康人及乙肝患者血浆中甘露聚糖结合凝集素含量。结果:42位HBVDNA阳性患者血浆MBL的含量为5.414±2.658mg/L，52位HBVDNA阴性患者血浆MBL的含量为4.949±2.219mg/L,40位健康人血浆MBL的含量为2.874±1.717mg/L,HBVDNA阳性患者与HBVDNA阴性患者血浆MBL的含量差异无统计学意义(t=0.761，P>0.05)，HBVDNA阳性患者与健康人血浆MBL的含量差异显著(t=5.810，P<0.01)，HBVDNA阴性患者与健康人血浆MBL的含量差异显著(t=4.786，P<0.01)。结论：乙肝患者血浆MBL 水平较健康人提高，说明机体分泌急性时相蛋白MBL参与机体免疫防御及监视。

　　【关键词】 甘露聚糖类;肝炎/乙型;肝炎病毒/乙型

　　Analysis of MBL Plasma Concentration of Patients with Hepatitis B

　　ZHAO Tiejun,YANG Cuijun,HOU Lijuan,et al

　　Lab Center，Hebei North University，Zhangjiakou，075000，Hebei，China

　　【ABSTRACT】 Objective:to investigate the concentration of mannan binding lectin of patients with Hepatitis B and further assess their innate immunity.Methods:detect the concentration of MBL with MBL ELISA kit.Results:the average of MBL plasma concentration in HBVDNA(+) was 5.414±2.658mg/L,and the average of MBL plasma concentration in HBVDNA(-) was 4.949±2.219mg/L,there was no statistical significence(t=0.761，P>0.05);the average of MBL plasma concentration in healthy was 2.874±1.717mg/L,there was statistical significance between HBVDNA(+) of patients and that of the healthy(t=5.810，P<0.01);there was statistical significance between HBVDNA(-) of patients and that of the healthy(t=4.786，P<0.01).

　　【KEY WORDS】 Mannans,Hepatitis B,Hepatitis B Virus

　　肝炎因感染的病毒类型不同而分为甲、乙、丙、丁、戊等多种，但临床所见还是以慢性乙型肝炎为多。我国是乙肝的高发区，乙肝病毒的感染率非常高，病情隐匿，危害性较大，传染性较强，乙型肝炎病毒(HBV)是引起乙肝的病原体。甘露聚糖结合凝集素(mannan binding lectin，MBL)又称甘露聚糖结合蛋白(mannanbinding protein,MBP)，是一种由肝脏合成和分泌的急性时相蛋白，能选择性识别甘露聚糖,MBL通过激活补体、调理吞噬作用达到清除病原体的作用,近年来研究表明MBL在机体免疫防御及监视中起重要作用[1]。本文测定了慢性乙肝患者及健康人的血浆MBL 含量,同时用乙型肝炎病毒核酸扩增荧光检测方法测定慢性乙肝患者血清HBVDNA含量，进行相关性分析。

　　1 材料与方法

　　1.1 仪器与试剂

　　主要设备：低温高速离心机(德国，hearus);酶标仪(Star fax 2100);梯度PCR仪(德国，eppendorf)。

　　主要试剂：乙型肝炎病毒核酸扩增荧光检测试剂盒(中山医科大学达安基因诊断中心)。

　　MBL含量试剂盒(北京现代高达生物技术有限责任公司)。

　　1.2 实验方法

　　1.2.1 标本的收集 200512—200609月收集，健康人来自张家口市中心血站，经检验符合献血标准，均为健康献血员，共40人，女19人平均年龄37.12±7.98岁，男21人平均年龄37.57±8.37岁;慢性乙肝标本来自河北北方学院附属第一医院，经检验符合临床诊断标准，共94人，女46人平均年龄38.68±8.70岁，男48人平均年龄36.91±9.38岁;收集静脉血标本用EDTANa2抗凝(抗凝比例为10：1)，分离血浆，-80℃保存，供测定MBL含量。

　　1.2.2 HBVDNA定量测定 按试剂盒说明书进行操作。94例慢性乙肝标本进行了HBVDNA定量测定。

　　1.2.3 健康人及慢性乙肝患者血浆中MBL含量测定

　　标本及试剂准备：血浆标本溶解并恢复至室温，3500转/min，离心5min)。取上清2μL，用标本稀释液(PBS+0.05%BSA)对标本稀释200倍，混匀。所有实验用试剂均在室温平衡后使用。

　　操作步骤:

　　①加样 按实验要求，100μL/孔。空白对照，加标本稀释液，标准曲线依次加含MBL不同浓度(0，1，2，5，10，25，50，100ng/mL)的标准液各100μL，均作复空，根据标准曲线计算标本的含量。

　　②反应 取100μL加入酶标板中,置37℃水浴1h。

　　③洗板 将板中的液体弃去，每孔加入150μL洗板液进行清洗，室温静置3min，弃去洗板液，反复3遍。

　　④酶标抗体 每孔加入100μL酶标记的MBL抗体，37℃ 1h。使酶结合物与标本充分结合。

　　⑤清洗 操作同③。

　　⑥底物与显色 每孔加入底物A、B各50μL，室温避光15min。每孔加入终止液50μL，轻轻混匀20s。

　　⑦用酶标仪比色 测定波长为450nm，参考波长为620nm。

　　1.3 用SPSS12.0进行统计分析。

　　2009年2月赵铁军等：乙肝患者血浆MBL水平分析

　　2 结果

　　结果见表1～3。表1 HBVDNA(+)阳性者与HBVDNA(-)阴性统计表明HBVDNA(+)阳性略高于HBVDNA(-)阴性但差异无统计学意义(t=0.761，P>0.05)。 表2 HBVDNA阳性者血浆MBL含量与健康人比较统计表明,HBVDNA阳性患者与健康人血浆MBL的含量差异显著(t=5.810，P<0.01)。 表3 HBVDNA阴性者血浆MBL含量与健康人比较统计表明,HBVDNA阴性患者与健康人血浆MBL的含量差异显著(t=4.786，P<0.01)

　　3 讨论

　　乙肝是常见的、严重威胁人类健康的病原体之一,机体感染HBV后出现免疫标志。常用实验室诊断指标为HBV抗原抗体检测(ELISA)和HBVDNA检测。血中HBVDNA的存在是HBV感染最为直接、最为敏感和特异的指标，更能反映乙肝患者体内HBV复制情况和感染性的强弱。

　　人类MBL基因位于10q11.2q21，由一个5′启动子区域、四个外显子和三个内含子组成，编码产物为MBL，是一种由肝脏产生可溶性的的C型凝集素，结构类似于C1q。人类甘露(聚)糖结合凝集素(MBL)由肝细胞合成后释放入血，以游离的形式存在，也可与细胞膜结合，以膜结合蛋白形式存在。MBL识别表达于病原体上的甘露聚糖和与其相似的糖基，从而通过调理吞噬作用和/或Lectin途径激活补体而导致其结构破坏，在机体的固有性免疫应答方面发挥重要作用。大多数研究显示，血清MBL低水平或缺失，无论是单独或是联合其他方面的相关的缺陷都可能会增加感染性疾病的易感性和感染的严重性[8],这与MBL在宿主防御方面发挥着重要作用有关。MBL低水平与许多疾病如各种病原体的反复感染等均有一定的相关性。血清中MBL的水平主要由MBL编码基因结构决定，并受启动子区域基因的活性调节[3～5]。

　　由于MBL作为急性期反应蛋白,机体不同的生理及病理状态都对MBL的表达产生影响，最近国外学者报道乙肝患者能否康复与MBL水平及基因有很大程度的相关性[6]。为此我们使用北京现代高达生物技术有限责任公司生产的MBL含量试剂盒测定健康人与乙肝患者血浆的MBL含量，42位HBVDNA阳性患者血浆MBL的含量为5.414±2.658mg/L，52位HBVDNA阴性患者血浆MBL的含量为4.949±2.219 mg/L,40位健康人血浆MBL的含量为2.874±1.717mg/L，HBVDNA阳性患者与HBVDNA阴性患者血浆MBL的含量差异无统计学意义(t=0.761，P>0.05)，HBVDNA阳性患者与健康人血浆MBL的含量差异显著(t=5.810，P<0.01)，HBVDNA阴性患者与健康人血浆MBL的含量差异显著 =4.786，P<0.01)，通过以上实验得出乙肝患者血浆MBL 水平较健康人提高，这表明感染病原体后机体分泌急性时相蛋白MBL参与机体免疫防御及监视。人体的免疫防御功能发挥了重要作用，产生大量MBL，通过调理吞噬作用和Lectin途径激活补体而导致病原体结构破坏。 我们初步作了以上的实验，有关深入研究正在进行之中。

　　【参考文献】

　　1 赵铁军，贾天军.北方汉族人MBL ExonⅠ52位基因频率调查[J].中国免疫学杂志，2005,21(5)：345346

　　2 赵铁军,韩瑞，罗强.汉回蒙古族人MBL EXON I 52位基因频率检测及其意义[J].广东医学，2005,26(5)：608609

　　3 赵铁军，贾天军，程建君.检测MBL EXON I 52位密码子突变PCRSSP方法的建立[J].国外医学临床生物化学与检验学分册，2004,25(5)：396398

　　4 贾天军,李萍,张庶民,等.MBL ExonI 54位基因突变检测方法的建立及初步应用[J].中国生物制品学杂志,2003,16(6):327329

　　5 贾天军,李萍,张庶民，等.汉、蒙古族人MBL基因Exon I 54位密码子点突变频率及其血浆含量相关性研究[J].中华微生物学和免疫学杂志,2004,24(2):115119

　　6 Chloe L,Timothy M,Jacquie A,et al.Mannose binding lecting genotypes influence recovery from hepatitis B virus infection[J].J Virol,2005,79(14):91929196