“氟达拉滨+马利兰”预处理异基因造血干细胞移植治疗白血病的临床观察

　　作者：王剑利，张王刚，曹星梅，陈银霞，何爱丽，刘 捷，马肖容，杨 云，赵万红，杨惠云 作者单位：(西安交通大学医学院第二附属医院血液科，陕西西安 710004)

　　【摘要】 目的 探讨使用“氟达拉滨+马利兰(Flud+Bu)”预处理方案行异基因造血干细胞移植治疗白血病的临床疗效。方法 6例患者中，慢性粒细胞白血病(CML)慢性期2例，急性淋巴细胞白血病(L2型)2例，急性非淋巴细胞白血病(M5型)1例，骨髓增生异常综合征(MDS)转化急非淋白血病1例。预处理方案包括氟达拉滨30mg/(m2·d)×4d，注射用马利兰3.2mg/(kg·d)×2～4d;非血缘移植患者加用兔抗人胸腺细胞球蛋白(ATG)2.5mg/(kg·d)×3d;供者为其HLA配型相合的同胞或非血缘;输注外周血造血干细胞数合计CD34+细胞3.0～8.03×106/kg(平均4.29×106/kg)，单个核细胞6.74～13.51×108/kg(平均9.01×108/kg);采用“环孢霉素+短疗程甲氨喋呤”预防移植物抗宿主病(GVHD)。结果 所有患者均未发生严重的预处理相关并发症;其中5例患者重建造血，检测外周血白细胞STRDNA证实均为完全供者植入;1例急淋L2患者在移植后早期(<30d)白血病复发导致死亡，其余5例患者随访8～20个月(中位时间10个月)均存活，至今无白血病复发。结论 “氟达拉滨+马利兰”预处理方案移植相关并发症轻，治疗恶性血液病安全可行，远期疗效尚待评估。

　　【关键词】 造血干细胞移植;白血病;预处理;氟达拉滨;疗效

　　Fludarabine plus busulfan conditioning regimen for allogeneic hematopoietic

　　stem cell transplantation in treating leukemia patientsWANG Jianli, ZHANG Wanggang, CAO Xingmei, CHEN Yinxia, HE Aili,

　　LIU Jie, MA Xiaorong, YANG Yun, ZHAO Wanhong, YANG Huiyun

　　(Department of Hematology, the Second Affiliated Hospital,

　　Medical School of Xian Jiaotong University, Xian 710004, China)ABSTRACT: Objective To explore the clinical efficacy of fludarabine plus busulfan conditioning regimen for allogeneic hematopoietic stem cell transplantation (alloHSCT) in treating leukemia patients. Methods Of the 6 patients, 2 had chronic myelogenous leukemia in their chronic phase, 2 had acute lymphoid leukemia, 1 had acute myeloid leukemia and 1 had acute myeloid leukemia transformed from myelodysplastic syndrome (MDS). The conditioning regimen included fludarabine 30mg/m2·d for 4 days, intravenous injection of busulfan 3.2mg/kg·d for 2 to 4 days, and rabbit antihuman thymocyte globulin 2.5mg/kg·d for 3 days in patients with unrelated donor. The number of infused peripheral blood stem cells was 3.0-8.03×106 CD34+ cells/kg (average of 4.29×106/kg) and that of peripheral blood mononuclear cells was 6.74-13.51×108 cells/kg (average of 9.01×108/kg). Cyclosporine and shortterm methotrexate were used to prevent graftversushost disease. Results No severe regimenrelated toxicity occurred in any of the patients. Five patients achieved hematopoiesis recomstruction with their full donor chimerisms confirmed by STRDNA analysis. The other one had leukemia relapse within one month after HSCT. Except the earlyrelapsing patient who died later, the other 5 patients remained alive without relapse in the followup duration of 8 to 20 months (median of 10 months). Conclusion The conditioning regimen with fludarabine plus busulfan is safe and effective in treating patients with hematopoietic malignant diseases with fewer complications. The longterm efficacy needs further evaluation.

　　KEY WORDS: hematopoietic stem cell transplantation; leukemia; conditioning regimen; fludarabine; curative effect

　　异基因造血干细胞移植(allogeneic hematopoietic stem cell transplantation, alloHSCT)是目前治愈恶性血液病的最有效手段，但常规的“Bu/Cy”(马利兰+环磷酰胺)预处理[1]常伴有较高的移植相关并发症和死亡率，对年龄较大、全身状况差和重要脏器功能缺陷的患者不能耐受。我们采用“氟达拉滨+马利兰”预处理方案对6例恶性血液病患者进行alloHSCT，收到较好疗效，现报道如下。

　　1 材料与方法

　　1.1 病例 2007年12月至2009年8月在我院确诊的恶性血液病患者，其中男3例，女3例，年龄13～49岁(平均29岁)。病例分型：慢性粒细胞白血病(CML)慢性期2例，急性淋巴细胞白血病(ALLL2型)2例，急性非淋巴细胞白血病(AMLM5型)1例，骨髓增生异常综合征(MDS)转化急非淋白血病1例。诊断根据张之南等主编的《血液病诊断与疗效标准》[2];接受alloHSCT前MDS转化急非淋白血病患者处于化疗后部分缓解(PR)期，另3例急性白血病患者均处于化疗后完全缓解期(2例CR1，1例CR2)。并发症：1例49岁的慢性粒细胞白血病患者合并陈旧性结核导致的孤立肾。

　　1.2 移植方法 6例患者均接受alloHSCT，其中4例为HLAA、B、DRB1位点全相合同胞移植，2例患者接受由中华骨髓库提供的非血缘无关供者移植，其中1例为HLAA、B、DRB1、Cw、DQ位点(10/10)全相合，另1例为上述位点中1个位点不合(9/10相合);ABO血型相合5例，主要、次要均不合1例。供者均在移植前3～4d接受重组人粒细胞集落刺激因子(GCSF)5～10μg/(kg·d)皮下注射动员造血干细胞，移植当天经Cobe Spectra血细胞分离机采集外周血造血干细胞输注给患者，受者按体重共输注单个核细胞数6.74～13.51×108/kg(平均9.01×108/kg)，CD34+细胞数3.0～8.03×106/kg(平均4.29×106/kg)。

　　1.3 预处理方案 全部患者采用“氟达拉滨+马利兰”预处理，其中5例患者为“清髓”移植方案，即氟达拉滨(Flud)30mg/(m2·d)×4d，注射用马利兰(Bu)3.2mg/(kg·d)×4d，在非血缘移植患者静脉加用兔抗人胸腺细胞球蛋白(ATG)2.5mg/(kg·d)×3d;合并孤立肾的CML患者采用“非清髓”移植方案，即氟达拉滨30mg/(m2·d)×4d，注射用马利兰3.2mg/(kg·d)×2d，ATG 2.5mg/(kg·d)×2d。移植物抗宿主病(graftversushost disease, GVHD)的预防在同胞移植患者采用环孢霉素(CSA)+短疗程甲氨喋呤(MTX)，即CSA 2.5mg/(kg·d)分2次静脉注射，从预处理第1天开始，维持血药谷浓度在150～250ng/mL，一般在移植后1个月左右改为口服，移植后+60～+90d开始逐渐减量，维持应用达6～12个月;MTX：15mg/m2静脉注射(+1d)，10mg/m2静脉注射(+3和+6d)。非血缘移植患者在CSA+MTX基础上加用霉酚酸酯(MMF)1.0～1.5g/d口服，+60d后MMF减量至停用(患者一般资料及预处理方案详见表1)。

　　1.4 支持治疗 全部患者入住层流无菌病房，全环境保护，间断输注辐照血小板和红细胞，在“粒缺期”(外周血中性粒细胞绝对数<0.5×109/L)给予皮下注射GCSF，血小板低于20×109/L时皮下注射重组人白介素11 1.5mg/d;应用前列腺素E1(PGE1)预防肝静脉阻塞综合征(venoocclusive disease, VOD);应用更昔洛韦5mg/(kg·12h)静脉注射(从预处理第1天用至移植前1d，然后替换为无环鸟苷0.8g/d口服)预防巨细胞病毒(CMV)感染。

　　1.5 植活及嵌合体分析 造血干细胞植活标准，即外周血中性粒细胞绝对计数>0.5×109/L，持续3d，血小板计数>20×109/L，连续1周不输注血小板。采用分子生物学方法，即实时定量(realtime)RTPCR检测骨髓单个核细胞bcrabl或WT1基因的表达来监测移植后微小残留病灶(minimal residual disease, MRD)。全部供、受者(包括移植前、后)留取外周血标本，采用荧光标记的多重PCR扩增DNA短串联重复序列(STR)来鉴定供者干细胞植入情况。血型不合供、受者监测移植后受者的血型变化。观察时间截止到2009年8月，中位随访时间10(2～20)个月。

　　2 结 果

　　2.1 移植后造血重建及患者的生存状况 5例患者重建造血，中性粒细胞绝对数>0.5×109/L的中位时间为11(8～12)d，无输注血小板>20×109/L的中位时间为13(12～13)d，其中接受“非清髓”移植的CML患者未发生“粒缺”和血小板<20×109/L;移植后+30和+60d左右复查这5例患者的骨髓涂片均显示有核细胞增生活跃，粒、红系细胞形态、比例大致正常，巨核细胞数目不低于正常值;随访8～20个月(中位时间10个月)这5例患者全部存活，至今无疾病复发。1例急淋L2患者在接受无关供者(HLA 9/10相合)造血干细胞移植后第16天检测外周血白细胞总数超过100×109/L，骨髓涂片和流式细胞仪分析证实为白血病复发，该患者于移植后+24d死亡。移植总体生存(overall survival, OS)及无病生存(diseasefree survival, DFS)率均为83.3%(5/6)。1例MDS转化的急非淋白血病患者移植前骨髓单个核细胞WT1基因定量PCR检测阳性，移植后再次检测为阴性;2例CML患者移植前bcrabl为阳性，移植后检测1例转阴，另1例仍为阳性。表1 异基因造血干细胞移植患者的一般资料及预处理方案

　　2.2 移植相关不良反应及并发症 所有患者在移植过程中均未发生出血性膀胱炎、重症感染或出血、VOD、间质性肺炎等严重并发症。2例患者在静脉应用ATG期间出现寒战、高热的血清病反应，应用糖皮质激素后体温恢复正常。4例患者在移植预处理后出现轻至中度消化道黏膜炎症，经加强护理，应用抑酸及黏膜保护剂等1周左右症状消失。包括“孤立肾”的CML患者在内，所有移植患者均未发生肾功能损害，但均出现不同程度的血清转氨酶和γ谷氨酰转肽酶升高，经保肝药物治疗后均恢复正常。realtime PCR监测血清巨细胞病毒DNA定量发现，3例患者移植后+60d内出现CMV血症，经更昔洛韦5mg/(kg·12h)静脉注射治疗2周后病毒定量转阴。2例患者发生急性移植物抗宿主病(aGVHD)，其中1例表现为局部皮疹的Ⅰ度aGVHD，经加用糖皮质激素治疗后好转;另1例为非血缘移植患者在免疫抑制剂减量过程中出现局部皮疹伴肝功能损害的Ⅱ度aGVHD，CSA加量后症状消失。可评估的慢性GVHD(cGVHD)发生2例，1例表现为全身泛发的皮肤色素沉着及局部皮肤色素脱失，并伴有反复的口腔溃疡，皮肤活检病理提示cGVHD，该患者目前为移植后20个月，免疫抑制剂已全部停用，在持续观察中;另1例患者在移植后6个月时表现出全身皮肤瘙痒伴肝功能中度损害，加用糖皮质激素治疗后上述症状明显减轻。

　　2.3 移植标志物检测 除早期复发死亡病例外，其余5例患者在移植后20～30d内检测外周血白细胞STRDNA证实均为完全(100%)供者植入;其中1例ABO血型不合患者在移植后45d左右转为供者血型，移植后患者情况详见表2。表2 异基因造血干细胞移植后患者的临床特征

　　3 讨 论

　　异基因造血干细胞移植(alloHSCT)预处理的目的是清除体内原有的造血细胞，最大限度地杀灭白血病或肿瘤细胞，同时抑制受者的免疫，从而保证供者健康造血干细胞的植入，以达到造血和免疫系统的重建。因而预处理过程常采取超大剂量的放、化疗。经典的“清髓”移植方案如THOMAS[3]提出的全身照射TBI 1200cGy+环磷酰胺60mg/(kg·d)×2d及SANTOS[1]提出的马利兰4mg/(kg·d)×4d+环磷酰胺50mg/(kg·d)×4d(Bu/Cy)预处理，都可能会产生对机体主要脏器的损害以及合并感染、出血等并发症，严重时甚至危及患者生命。文献报道，常规的Bu/Cy预处理相关并发症高达20%～50%，并随受者年龄的增大而增加[4]。降低预处理的强度，利用移植物抗白血病(graftversusleukemia, GVL)效应减少白血病复发的“小移植(minitransplantation)”或称“非清髓移植(nonmyeloablative transplantation)”方案[5]能减少预处理有关的死亡率，但与经典方案相比白血病的复发率增加。

　　2003年来自德国和美国西雅图的联合研究报道[6]，应用氟达拉滨30mg/(m2·d)×4d和口服马利兰4mg/(kg·d)×4d的预处理方案，治疗42例高危CML和MDS患者(平均年龄52岁，供者为HLA全相合的同胞或非血缘)，结果全部患者完全植入，100d内的预处理相关死亡率只有7%，随访13～27个月的OS和DFS分别为42.4%和34.9%。2004年美国Anderson癌症中心[7]报道，用氟达拉滨40mg/(m2·d)×4d+注射用马利兰130mg/(m2·d)×4d的预处理方案治疗74例AML和22例MDS患者，1年预处理相关死亡率和治疗相关死亡率仅分别为1%和3%，1年OS和DFS在所有患者中为65%和52%，而在接受移植的完全缓解病例中高达81%和75%。研究者称该方案为一种低毒、清髓的预处理方案。ALYEA等[8]回顾分析了50岁以上的患者中采用非清髓“氟达拉滨+马利兰”预处理移植[Flud 30mg/(m2·d)×4d，注射用Bu 0.8mg/(kg·d)×4d]与经典的环磷酰胺+全身照射(TBI)清髓移植方案的远期疗效及并发症等方面的比较，发现尽管接受“氟达拉滨+马利兰”非清髓移植方案的肿瘤患者有较高的疾病复发率(46% vs. 30%)，但由于非复发死亡率比清髓移植患者明显减少(32% vs. 50%)，故1年和2年的总体生存(OS)率前者均优于清髓移植。结论是氟达拉滨+马利兰非清髓alloHSCT总体疗效至少与经典清髓移植相当。

　　我们从2007年开始应用“氟达拉滨+马利兰”预处理方案治疗6例恶性血液病患者，迄今为止收到较好的疗效。6例患者均安全耐受移植，未发生严重的预处理相关并发症。5例患者重建造血，白细胞和血小板恢复时间同传统Bu/Cy移植相似，且全部达到100%供者植入。随访至今的OS和DFS率均为83.3%(5/6)。1例合并“孤立肾”的49岁CML患者，因其总肾小球滤过率(GFR)小于正常的50%，故我们在预处理时采用非清髓方案[Flud 30mg/(m2·d)×4d，Bu 3.2mg/(kg·d)×2d]，并应用ATG保证造血干细胞植入，结果患者未发生严重并发症，STRDNA检测也达到了100%供者植入，观察至今无白血病复发，经查阅国内、外文献未见类似“孤肾”病例接受alloHSCT的报道。普遍认为清髓移植后白血病的复发率在20%左右，复发因素与细胞类型、移植前瘤细胞负荷、HLA配型以及有无GVHD等都有关。本组研究中1例L2患者早期复发死亡，总体复发率未高于传统移植。另外采用“氟达拉滨+马利兰”预处理方案移植的患者发生GVHD的比例较高(aGVHD和cGVHD各发生2例)，但没有2度以上的重型aGVHD。分析原因应与Flud具有更强的免疫抑制作用有关，而一旦供者造血干细胞成功植入，不受Flud免疫抑制，因而能在受者体内起到较明显的抗宿主和清除残存肿瘤细胞的作用，减少白血病的复发。总之，“氟达拉滨+马利兰”预处理是一种低毒的移植前预处理方案，对机体的损害比传统Bu/Cy或TBI+Cy方案小，降低了移植相关并发症的发生，从而扩大了移植适应证。由于本组研究的例数较少且随访时间尚短，长期疗效仍需观察评估。

　　【参考文献】

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　　[4]DEEG HJ, SHULMAN HM, ANDERSON JE, et al. Allogeneic and syngeneic marrow transplantation for myelodysplastic syndrome in patients 55 to 66 years of age [J]. Blood, 2000, 95(4):11881194.

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　　[7]DE LIMA M, COURIEL D, THALL PF, et al. Oncedaily intravenous busulfan and fludarabine:clinical and pharmacokinetic results of a myeloablative, reducedtoxicity conditioning regimen for allogeneic stem cell transplantation in AML and MDS [J]. Blood, 2004, 104(3):857864.

　　[8]ALYEA EP, KIM HT, HO V, et al. Comparative outcome of nonmyeloablative and myeloablative allogeneic hematopoietic cell transplantation for patients older than 50 years of age [J]. Blood, 2005, 105(4):18101814.